ЖУРНАЛ ФИЗИЧЕСКОЕ ХИМИИ, 2013, том 87, № 6, с. 1008-1011
ФИЗИЧЕСКАЯ ХИМИЯ НАНОКЛАСТЕРОВ И НАНОМАТЕРИАЛОВ
УДК 541.64:662.728
СТАБИЛИЗАЦИЯ НАНОЧАСТИЦ СЕЛЕНА ХИМОТРИПСИНОМ: ВЛИЯНИЕ рН И КОНЦЕНТРАЦИОННОГО СООТНОШЕНИЯ НАНОЧАСТИЦА-ФЕРМЕНТ НА СТАБИЛЬНОСТЬ НАНОКОМПЛЕКСОВ © 2013 г. Л. Н. Боровикова, А. В. Титова, Н. А. Матвеева, О. А. Писарев
Российская академия наук, Институт высокомолекулярных соединений, Санкт-Петербург
E-mail: pisarev@imc.macro.ru Поступила в редакцию 10.05.2012 г.
Изучены условия образования растворимых комплексов химотрипсина с наночастицами селена. Установлено, что агрегативная стабильность нанокомплексов определялась условиями их получения, а также зависела от рН среды и концентрационного соотношения селен:химотрипсин. Показано, что "защитное" действие химотрипсина связано с его гидрофобной адсорбцией на поверхности наночастиц селена, и соответственно, гидрофилизацией их поверхности за счет ионизованных групп белка.
Ключевые слова: селен, химотрипсин, наночастицы, нанокомплексы, адсорбция, белок.
Б01: 10.7868/80044453713060058
Известные методы иммобилизации ферментов, использующие в качестве носителя полимеры, обладают общим недостатком. Полимерная матрица создает значительные стерические препятствия для диффузии субстрата к ферменту, при этом достигаемое при иммобилизации на полимерах повышение стабильности фермента сопровождается понижением его каталитической активности [1, 2].
Перспективной представляется идея иммобилизации ферментов на наночастицах: резкое увеличение удельной поверхности наночастиц и доступности сорбционных центров (по сравнению с известными носителями) должно приводить к реализации многоточечного взаимодействия фермента с наночастицей и, соответственно, к стабилизации его конформации. При этом, микрокап-суляция наночастиц в полимерной оболочке фермента может способствовать уменьшению диффузионных затруднений при перемещении субстрата к активному центру фермента.
Вместе с тем, в определенных физико-химических условиях фермент при взаимодействии с гидрофобными наночастицами, может изменить гидрофобную природу их поверхности на гидрофильную, а гидрофильные коллоиды намного стабильнее в водных средах. Таким образом, фермент может являться стабилизатором наночастиц в растворе.
Если осуществлять иммобилизацию ферментов на наночастицах, обладающих собственной биологической активностью, то появляется возможность совмещения различных полезных био-
логических свойств в одном нанокомпозите. Состав и количество компонентов в нанокомпозите можно регулировать в зависимости от поставленных конкретных задач медицины или биотехнологии. Очевидно, что такие исследования являются физико-химической основой для создания полифункциональных лекарственных средств нового типа с широким спектром действия.
Гидролитический фермент химотрипсин (ХТ) выбран в качестве матрицы, так как он широко применяется в медицине, биотехнологии и пищевой промышленности. В качестве носителя ХТ выбраны наночастицы селена. Селен и его комплексы с биологически активными веществами представляют большой интерес в качестве лекарственных препаратов с антиоксидантной, противовоспалительной и антиканцерогенной активностью [3—6].
В работах [7—9] показано, что фермент, связанный с наночастицами селена сохраняет, а в ряде случаев увеличивает свою протеолитическую активность (по сравнению со свободным ферментом).
Цель настоящей работы — исследование агрега-тивной стабильности нанокомплексов химотрип-сина с наночастицами селена в широком диапазоне рН и концентрационных соотношений наноча-стица-фермент для определения интервалов использования иммобилизованного фермента.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовались селенистая и аскорбиновая кислоты, 2-меркаптоэтанол, а-химот-рипсин ("Вектон", С.-Петербург). Вещества растворялись в апирогенной воде для инъекций, дополнительно фильтрованной через стеклянный фильтр.
Измерение оптической плотности проводилось на спектрофотометре "SPECORD М-40" в диапазоне длин волн 220—900 нм в кварцевых кюветах объемом 2.5 см3. Для измерения рН среды использовался милливольтметр рН-673М.
Величины констант скорости (к) реакции формирования наночастиц и нанокомплексов были рассчитаны по методу Гуггенгейма [10]. По мере образования нанокомплексов значение оптической плотности при X 280нм постепенно нарастало и в равновесии достигало постоянного значения. Время установления равновесия находилось в интервале от 18 до 24 ч.
Расчет к проведен по формуле:
к = Ы(Вк/(Вк — (1)
где Бк — оптическая плотность в состоянии равновесия, В { — оптическая плотность в определенный момент времени t .
Синтез нанокомпозитов селена с ХТ осуществлялся в ходе реакции восстановления селенистой кислоты аскорбиновой кислотой в водной среде при рН от 2.8—3.5, Т = 293 К и атмосферном давлении согласно реакции: Н^е03 + 2С6Н806 ^ Se + 3Н20 + 2С6Н606. (2)
В результате реакции (2) в отсутствие ХТ происходило образование золя нуль-валентного красного аморфного селена ^е°) и дегидроаскорбино-вой кислоты. Образование нуль-валентного селена показано ранее [11]. Золь не устойчив в растворе и выпадал в осадок через ~24 ч. Кроме того, через 7—10 сут. селен из аморфной красной формы переходил в другую модификацию — серый металлический селен. Таким образом, в отсутствие ХТ наночастицы селена являлись лио-фобными коллоидами с низкой агрегативной устойчивостью.
Введение в реакцию (2) одновременно с другими компонентами ХТ приводило к получению стабильных растворов красновато-оранжевого цвета. После синтеза в присутствие ХТ наночастицы селена сохраняли стабильное состояние в растворе в течение 6 месяцев, при этом после выпадения в осадок селен не менял модификацию. Это свидетельствовало о том, что ХТ при кислых значениях рН, где он несет положительный заряд, являлся эффективным стабилизатором на-ночастиц селена в растворе. Гидродинамический радиус (Яъ) стабилизированных нанокомплеков изменялся в интервале от 70 до 420 нм [7].
С^е, мас.%
Рис. 1. Зависимости константы скорости реакции образования красного аморфного селена без ХТ (1) и в присутствии 0.1 (2) и 0.01 мас. % ХТ (3).
Агрегативная стабильность нанокомплексов в растворе изучена в зависимости от рН и от параметра V в интервале значений от 0.5 до 10 (V — отношение концентрации селена к концентрации ХТ, V = С^е/СХТ). Концентрация ХТ в большинстве экспериментов сохранялась постоянной (Схт = = 0.01 мас. %).
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
На рис. 1 показаны зависимости константы скорости реакции образования наночастиц от концентрации селена в отсутствие и присутствии ХТ. В присутствии стабилизирующего фермента наблюдался рост константы скорости, начиная с С^ = 0.01 мас. %. До этой точки константы скорости близки во всех изученных случаях. Именно в этом случае, по видимому, происходило насыщение адсорбционной емкости поверхности наночастиц.
Исследование кинетики изменения рН для на-нокомплексов при V = 1 (С^е = 0.01%; Схт = = 0.01%), показало, что равновесие устанавливалось на 5—6 сут. Исключение составляла область рН 11—12, где равновесные значения устанавливались через ~24 ч. При других V экспериментальные зависимости аналогичны.
На рис. 2 показано влияние V на агрегативную стабильность нанокомплексов при различных рН в состоянии равновесия (черным цветом показаны области полного фазового разделения системы, серым цветом области нестабильного поведения нанокомплексов, а белым — области, когда нанокомплексы представляли собой окрашенный стабильный раствор).
1010
БОРОВИКОВА и др.
РН
10
ниш
0.5
1.5 2 4 6
10
V
Рис. 2. Влияние V на агрегативную стабильность на-нокомплексов при различных рН; Схт = 0.01 мас. %.
Агрегативно стабильные в растворе наноком-плексы наблюдались в кислой области (2.8—3.75) и при щелочных значениях рН (7.1—10.5). Значения рН, при которых наблюдалось полное фазовое разделение системы, находились в интервале от 3.75-4.0 до 6.5-7.0.
Следует отметить, что рН интервалы областей фазового разделения системы практически не зависели от концентрации селена в растворе и лишь при высоких концентрациях (при V = 8 и 10) появлялась еще одна область полного фазового разделения при сильно щелочных значениях рН. Можно полагать, что при сохранении постоянства концентрации Схт увеличение концентрации селена до V = 8 и V = 10 приводило к недостаточной плотности упаковки молекул ХТ на наноча-
стицах. Соответственно, взаимодействие "незакрытых" молекулами ХТ участков наночастиц способствовало их агрегации, нестабильности на-нокомплексов и фазовому разделению системы.
Для исследования состояния нанокомплек-сов, были сняты спектры поглощения в УФ и видимой области.
На рис. 3 представлен график зависимости оптической плотности от длины волны для наноси-стемы при V = 1. Следует отметить, что для всех наносистем, которые представляли собой окрашенный стабильный раствор кривые группировались в одной области графика, вне зависимости от значений рН среды (кривые 1-3). Для систем в состоянии фазового разделения появлялся максимум на кривой зависимости оптической плотности от длины волны и уменьшалось абсолютное значение оптической плотности (кривые 4, 5).
Для выяснения влияния количества фермента-стабилизатора были проведены эксперименты по синтезу нанокомплексов при концентрации ХТ 0.1 мас. %.
Как видно из рис. 4, интервалы фазового разделения системы уменьшались, так же как и интервалы нестабильного состояния системы. Таким образом, увеличение концентрации белка-стабилизатора расширяло интервалы агрегативно стабильного состояния наносистем при изменении рН среды. Согласно реакции (1) синтез нано-композитов проводился в кислой среде, где ХТ заряжен положительно.
Нами проведен синтез нанокомпозитов в щелочной области (рНисх.р-ра 9.0-10.5), когда ХТ заряжен отрицательно, а его конформационное состояние характеризуется более плотной внутренней упаковкой [12]. В качестве восстановителя использовался 2-меркаптоэтанол [13]
5
8
1
В 0.6
300
400
500
600 700
X, нм
Рис. 3. Зависимости оптической плотности от длины волны для системы наноселен-химотрипсин; V = 1, рН:
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.