ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2007, том 43, № 6, с. 653-656
УДК 579.841.31.083.3
СТАБИЛИЗИРУЮЩЕЕ ВЛИЯНИЕ ЛЕКТИНОВ АЗОСПИРИЛЛ НА АКТИВНОСТЬ Р-ГЛЮКОЗИДАЗЫ
© 2007 г. С. А. Аленькина, В. Р. Жаркова, В. Е. Никитина
Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, 410049
e-mail: alenkina@ibppm.sgu.ru Поступила в редакцию 10.01.2006 г.
Показано, что лектины, выделенные с поверхности Azospirillum brasilense Sp7 и его мутанта по лек-тиновой активности Azospirillum brasilense Sp7.2.3, способны оказывать стабилизирующее влияние на активность Р-глюкозидазы сладкого миндаля при термоинактивации и действии протеолитиче-ских ферментов. Различия в эффектах, вызываемых лектинами, отличающимися антигенными свойствами, свидетельствуют о том, что влияние лектинов на каталитическую активность фермента связано не столько с их основным свойством - углеводной специфичностью (она у них одинакова), сколько с конформационными изменениями молекул лектинов, произошедших в процессе мутагенеза. Полученные данные важны при анализе участия лектинов в создании азотфиксирующей ассоциации.
Согласно современным представлениям, стабильность ферментов, т.е. способность сохранять каталитическую активность в определенных условиях (температура, рН, состав среды), определяется не только структурой самого фермента, но и характером комплексообразования с другими молекулами [1, 2]. Одним из распространенных подходов к стабилизации ферментов является введение в систему различного рода эффекторов, таких, как белки, ионы металлов, полиолы, полиспирты, поликислоты, полисахариды и аминокислоты. Механизм сохранения структуры молекулы фермента при взаимодействии с этими соединениями имеет сложный характер, однако во всех случаях наблюдается изменение конформации фермента при комплексообразовании с лигандами [3].
Ранее на поверхности клеток азотфиксирую-щих бактерий Azospirillum brasilense 8р7 был обнаружен, а затем выделен белок - лектин. Лектин являлся гликопротеином, имел молекулярную массу 36 кДа, проявлял специфичность к Ь-фуко-зе (1.87 мМ) и к Б-галактозе (20 мМ)[4]. Мутант-ные клетки имели на поверхности лектиновые молекулы с одинаковыми молекулярной массой и углеводной специфичностью. Лектин мутантных клеток в результате мутагенеза претерпел изменения, так как антитела, полученные к лектину А. brasilense 8р7, не взаимодействовали с лекти-ном мутантных клеток [5].
Известно, что лектины способны оказывать стабилизирующее действие на ряд ферментов при действии температуры, рН, протеаз [6, 7]. Стабилизирующее влияние лектинов имеет большое значение при функционировании иммобилизованных на мембранных структурах ферментов, а
также олигомерных и полиферментных комплексов [8].
Цель работы - сравнительное изучение способности лектинов А. brasilense 8р7 и А. brasilense 8р7.2.3 оказывать влияние на активность в-глю-козидазы сладкого миндаля при воздействии протеаз, а также на термо-, рН-стабильность этого фермента.
МЕТОДИКА
Микроорганизмы. В работе были использованы лектины двух штаммов - Azospirillum brasilense 8р7, полученного из Института микробиологии РАН (г. Москва) и мутанта данного штамма, дефектного по лектиновой активности -Azospirillum brasilense 8р7.2.3 [5]. Культуры азоспи-рилл выращивали на жидкой синтетической среде для флоккуляции при 37°С в течение 18 ч [9].
Обнаружение лектинов. Для обнаружения лектинов использовали реакцию гемагглютина-ции, проводимую с трипсинизированными эритроцитами кролика [10].
Выделение и очистка лектинов. Лектины выделяли с поверхности клеток по методу [11]. Очистку лектинов проводили с помощью гель-фильтрации на колонке с сефадексом 0-75. В качестве элюентов использовали 0.1 М СН3СООН, рН 4.8, и 0.05М фосфатный буфер, рН 7.0, с 0.15 или 0.85 М №С1. Гомогенность очищенных лектинов определяли с помощью электрофореза в 10%-ном полиакриламидном геле с ДДС-Ка.
Определение белка. Белок определяли по методу Бредфорд [12].
A, 425 нм
Рис. 1. Влияние лектинов А. ЬгазИете 8р7 и А. ЬгазИете 8р7.2.3: а - термостабильность (0.1 М ацетатный буфер, рН 4.6); б - рН-стабильность (0.1 М ацетатный буфер, 37°С) на активность в-глюкозидазы: исходная (1); в присутствии лектина А. Ьгазйете 8р7 (2); в присутствии лектина А. Ьгазйете 8р 7.2.3 (3). Концентрация лектинов - 40 мкг/мл.
Метод золотого блота. Взаимодействие лектинов с ферментом проводили методом дот-анализа на нитроцеллюлозных мембранах (диаметр пор 1.5 мкм); 1мкл раствора лектинов (использовали серию двукратных разведений) наносили на мембрану, расчерченную на квадраты, подсушивали и фиксировали при 60°С в течение 15 мин. Для предотвращения специфической сорбции метки как на образце, так и на поверхности носителя, мембрану инкубировали в растворе следующего состава: фосфатный буфер, рН 7.2; 0.2%-ный БСА; твин-20 в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем инкубировали в растворе коллоидного золота (частицы диаметром 15 нм), конъ-югированного с в- глюкозидазой в течение 12 ч.
Изучение влияния лектинов на термостабильность Р-глюкозидазы. Инкубировали 0.1 мл фермента и 0.1 мл лектина 30 мин при температуре от 20 до 70°С. Затем в пробы добавляли 0.1 мл п-нит-рофенил-Р-Б-глюкопиранозида и инкубировали 1 ч при 37°С. В качестве контроля была использована инкубационная смесь, не содержащая лектин. После чего реакцию останавливали добавлением 0.05 М №ОН-глицинового буфера, рН 10.6. Количество образовавшегося п-нитрофенола определяли спектрофотометрическим методом при 425 нм на СФ-26 (Россия). За единицу активности принимали количество фермента, которое гидролизовало 1 нмоль субстрата за 1 мин.
Изучение влияния лектинов на рН-стабиль-ность Р-глюкозидазы. Инкубировали 0.1 мл фермента и 0.1 мл лектина 30 мин при рН от 2 до 9, затем определяли активность фермента вышеописанным образом.
Изучение влияния лектинов на устойчивость фермента к протеазам. Инкубировали 0.1 мл раствора в-глюкозидазы с 0.1 мл растворов лектинов 30 мин при 37°С. Затем добавляли 0.1 мл раствора трипсина или химотрипсина различных концентраций (от 0.25 до 2 мкг/мл) и инкубировали 1ч
при 37°С. Затем определяли ферментативную активность.
Статистическая обработка. Экспериментальные данные обрабатывали статистически с использованием критерия Стьюдента [13]. Данные на графиках представляют собой средние арифметические из 5 опытов и их среднеквадратичные отклонения.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В предыдущих работах было показано, что лектины азоспирилл способны модифицировать активность в-глюкозидазы корней пшеницы [14]. Изучение влияния лектинов родительского и му-тантного штаммов на стабильность ферментов проводилось на модельной системе, включающей, наряду с вышеуказанными лектинами, в-глюко-зидазу сладкого миндаля (коммерческий препарат, фирма "Serva", Германия).
По нашим данным, которые согласуются с [15], оптимальной для в-глюкозидазы явилась температура 37°С. При значениях, отличных от оптимальной, активность фермента снижалась как при понижении температуры до 20°С, так и при повышении ее до 70°С. При добавлении к раствору в-глюкозидазы лектина A. brasilense Sp7 наблюдалось менее значительное уменьшение активности фермента по сравнению с контрольным вариантом (фермент без лектина) в интервалах 20-37°С и 37-70°С (рис. 1а). Данный факт свидетельствует о стабилизирующем влиянии лектина родительского штамма. В случае с лектином A. brasilense Sp7.2.3 стабилизирующий эффект отсутствовал при уменьшении оптимальной температуры и наблюдался лишь при 60 и 70°С (рис. 1а). Механизм стабилизации при образовании отдельных белок-белковых контактов заключается в следующем: на поверхности белка, наряду с полярными и заряженными группами, имеются "гидрофобные кластеры", и их контак-
СТАБИЛИЗИРУЮЩЕЕ ВЛИЯНИЕ ЛЕКТИНОВ АЗОСПИРИЛЛ
655
%
Рис. 2. Влияние лектииов А. Ьгазйете 8р7 и А. Ьгазйете 8р7.2.3 на активность (%) в-глюкозидазы при различных концентрациях трипсина (а), химотрипсина (б). 1 - фермент + трипсин (химотрипсин), 2 - фермент + лектин А. Ьгазйете 8р7 + трипсин (химотрипсин), 3 - фермент + лектин А. Ьгазйете 8р7.2.3 + трипсин (химотрипсин); 0.1М ацетатный буфер, рН 4.6, 37°С; за 100% принята активность фермента - 0.19 ед./мг; концентрация лектинов - 40 мкг/мл.
тирование с водой термодинамически невыгодно. При образовании комплекса молекула белка "садится" на этот кластер и тем самым закрывает его от контакта с растворителем [16-18]. Отличия оказываемого эффекта лектинами родительского и мутантного штаммов, видимо, связано с изменением структуры мутантного белка, произошедшего в ходе мутагенеза [5], результатом чего явилось изменение количества связей между молекулой фермента и лектиновыми молекулами. Увеличение термостабильности ферментов имеет большое значение, так как практически во всех случаях ферменты, стабильные к действию высоких температур, проявляют повышенную устойчивость также и к другим денатурирующим воздействиям: экстремальные значения рН, деструкция протеазами [19].
Не установлено влияния лектинов обоих штаммов на рН-стабильность в-глюкозидазы (оптимальное значение рН 4.6 [15]). Более того, инкубирование фермента с лектином родительского штамма при рН от 2 до 7 и лектином мутантного штамма при рН от 2 до 6 приводило к еще большему, чем в контроле, уменьшению активности фермента, то есть наблюдалось усиление ингибирующего действия кислотности среды в указанных интервалах (рис. 16). Видимо, это объясняется тем, что при данных значениях рН происходит ионизация функциональных групп лектинов, ответственных за взаимодействие с ферментом таким образом, что данные молекулы становятся ингибиторами.
Влияние лектинов азоспирилл на устойчивость в-глюкозидазы к деградации протеазами -трипсином и химотрипсином было неоднозначным. Трипсин является высокоспецифичным ферментом, гидролизующим пептидные связи по карбоксильной группе лизина и аргинина. Химотрипсин проявляет более широкую специфичность по сравнению с трипсином, так как может расщеплять пептидные связи других аминокислотных остатков, на-
пример лейцина, гистидина, метионина, серина, ва-лина [20].
В наших экспер
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.