БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2014, том 40, № 2, с. 170-177
УДК 547.415.057
СТАБИЛЬНЫЕ АНАЛОГИ КОФЕРМЕНТ-СУБСТРАТНОГО КОМПЛЕКСА СПЕРМИДИН/СПЕРМИН-^-АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗНОЙ РЕАКЦИИ. СИНТЕЗ, ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ФЕРМЕНТОМ
© 2014 г. Т. А. Кейнанен*, Т. Хивонен**, Й. Вепсалайнен*, Л. Алхонен**,
А. Р. Хомутов***, #, Ю. Янне**
*Департамент Фармации, Биоцентр Куопио, Университет Восточной Финляндии, Куопио, Финляндия **Центр молекулярных исследований им. А.И. Виртанена, Университет Восточной Финляндии, Куопио, Финляндия ***Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 119991, Москва, ул. Вавилова, 32 Поступила в редакцию 15.05.2013 г. Принята к печати 21.10.2013 г.
Предложен удобный двухстадийный метод синтеза конъюгатов аминооксианалогов спермина, спермидина и путресцина с коэнзимом А и Д-пантетеином. Использование ацетонового линкера позволяет получать целевые соединения с выходом, близким к количественному. Показано, что активность "бисубстратных" ингибиторов на основе коэнзима А, действующих в микромолярных концентрациях, намного превосходит активность соответствующих производных Д-пантетеина.
Ключевые слова: спермидин/спермин-Ы1-ацетилтрансфераза, ингибиторы, О-замещенные гидроксил-амины, ацетилкоэнзим А, аналоги полиаминов.
DOI: 10.7868/S0132342314020079
ВВЕДЕНИЕ
Создание стабильных аналогов промежуточных соединений ферментативных реакций, включая и аналоги промежуточных кофермент-субстратных комплексов, является одним из основных приемов для получения специфических и высокоэффективных ингибиторов ферментов (см. обзор [1]). Активность таких ингибиторов проявляется, как правило, в интервале 10-6—10-9 М, определяется сродством интермедиата и его аналога к активному центру и зависит от искажений, которые вносит линкер или связь, соединяющие субстраты и/или их аналоги в ковалентный комплекс [2—6]. Наиболее активными ингибиторами этого типа следует, по-видимому, считать аналоги изолейцила-денилата, ингибирующие изолейцил-тРНК-синте-тазу из Staphylococcus aureus в пико-/фемтомоляр-ных концентрациях [7].
Многие ацетил-СоА-зависимые трансферазы, включая и спермидин/спермин-Л^ацетилтранс-
Сокращения: CoASH и CoASAc — коэнзим А и его ацетильное производное; D-Pant — D-пантетеин (^-(D-патоте-нил)аминоэтилмеркаптан); Put — путресцин (1,4-диамино-бутан); Spm — спермин (1,12-диамино-4,9-диазадодекан); Spd — спермидин (1,8-диамино-4-азаоктан); нор-Spd — нор-спермидин (1,7-диамино-4-азагептан); SSAT — спер-мин/спермидин Л-ацетилтрансфераза). #Автор для переписки (тел.: +7 (499) 135-60-65; факс: +7 (499) 135-14-05; эл. почта: alexkhom@list.ru).
феразу (SSAT, КФ 2.3.1.57), осуществляют прямой перенос ацетильной группы с ацетил-CoA на второй субстрат, и стабильные аналоги соответствующих бисубстратных комплексов оказываются весьма эффективными ингибиторами, действующими в концентрациях 10-6—10-9 М (см. работу [8] и ссылки в ней).
Для ингибирования SSAT и родственной ей гистонацетилазы были синтезированы конъюга-ты симметричных полиаминов спермина (1,12-ди-амино-4,9-диазадодекан, Spm) и норспермидина (1,7-диамино-4-азагептан, нор-Spd) c коэнзимом А, моделирующие промежуточный кофер-мент-субстратный комплекс (рис. 1) [9, 10]. В случае гистонацетилазы эти соединения с ацетатным линкером, оказались весьма активными и действовали в наномолярных концентрациях [9], тогда как в случае SSAT они ингибировали фермент в концентрациях 0.3—3.0 мкМ, в зависимости от строения полиаминного фрагмента [10]. Недавно конъюгат Spm и коэнзима А с ацетатным линкером был использован в рентгеноструктурных исследованиях SSAT для изучения особенностей связывания субстратов в активном центре фермента [11].
Вклад пантетеинового фрагмента коэнзима А в его сродство к SSAT не исследован, а так как в случае сукцинил-СоА-ацетоацетаттрансферазы
H2N
O
R-CH2-NH--j-S-CoA CH3
Промежуточный кофермент-субстратный комплекс O
S>
CoA
Бисубстратный ингибитор с ацетатным линкером на основе нор-Spd [9—11]
N H
N H
N H
O
Ii
Me
Фосфинильный аналог N -ацетил-Spd [12]
HN- ^NH
2
H2N. ^NH
Пентамидин [13]
NH
H2N
N N H
Беренил [13]
NH NH2
Рис. 1. Строение промежуточного кофермент-субстратного комплекса и некоторые ингибиторы спермидин/спер-мин-Л^-ацетилтрансферазы (SSAT).
он весьма значителен [14], то в настоящей работе описаны новые конъюгаты полиаминов не только с коэнзимом А, но и с ^-пантетеином — последние могли бы проникать в клетку существенно эффективнее "бисубстратных ингибиторов" на основе коэнзима А. Для получения целевых ингибиторов был использован набор гидроксил-аминсодержащих аналогов Spm и Spd (рис. 2) с концевой аминооксигруппой [15—17], что позволило, используя ацетоновый линкер, синтезировать конъюаты коэнзима A и ^-пантетеина не только с симметричными, но и с несимметричными аналогами Spm и Spd. Обсуждаются результаты взаимодействия полученных ингибиторов с SSAT.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Одной из традиционных задач биохимии полиаминов является разработка методов истощения внутриклеточного пула Spm и Spd, учитывая их повышенное содержание в опухолевых клетках по сравнению с нормальными, и необходимость полиаминов для размножения болезнетворных трипаносоматидов (Plasmodium falciparum, Trypanosoma brucei gambiense, Leishmania donovani и т.п.) [18]. Для решения этой задачи используются два основных подхода: создание разнообразных специфических ингибиторов ферментов биосинтеза полиаминов [19, 20] и супериндукция SSAT — скоростьопределяющего фермента катаболизма полиаминов. Последний подход оказался более
эффективным — использование терминально бис-алкилированных производных Spm и его гомологов позволяло повышать активность SSAT в клетках в десятки и сотни раз, а большинство из этих соединений обладали еще и выраженной цито-статической активностью [21]. Поэтому интерес к созданию специфических ингибиторов SSAT был невысок, и спектр известных к настоящему времени ингибиторов фермента весьма ограничен. Например, противопаразитарные препараты Беренил (Berenil®) и Пентамидин (Pentamidine®) (рис. 1), ингибируют рекомбинантную SSAT человека с K 2.0 и 2.4 мкМ соответственно, однако механизм действия этих бисарилгуанидинов практически не исследован [13].
Поскольку SSAT-реакция протекает путем прямого переноса ацетильной группы с СоАБАс на субстрат, то для ингибирования фермента были синтезированы конъюгаты коэнзима А и симметричных полиаминов, Spm и нор-Spd, с использование ацетатного линкера [10]. Наиболее активным был конъюгат коэнзима А с нор-Spd (рис. 1), имевший IC50 0.3 мкМ, тогда как соответствующее производное Spm было на порядок менее активным. Это хорошо согласуется со сродством Spm и нор-Spd к SSAT; для них значения Km составляют 9.0 и 130 мкМ соответственно [10].
SSAT дискриминирует N1- и ^-аминогруппы Spd и избирательно ацетилирует аминогруппу лишь в первом положении полиамина. Схемы синтезов, предложенные в работах [9—11] были
h2n
N H
,NH2 • 3HCl AOEPut [15]
H2N
h2n
h2n'
N H
N H
4NH2 • 3HCl нор-AOEPut [16]
O
NH2 • 3HCl APAPA [15]
NH2 • 4HCl AOSpm [17]
Рис. 2. Гидроксиламинсодержащие аналоги Spm и Spd.
пригодны лишь для получения коньюгатов коэн-зима А с симметричными полиаминами. Позднее для получения коньюгатов коэнзима А, а также .О-пантетеина, избирательно по или ^-положениям Брё был специально разработан достаточно сложный многостадийный синтез [22], однако об активности и ^-производных Брё не сообщалось.
Попытки моделирования коэнзим-субстратно-го комплекса спермин/спермидин-ацетилтрансфе-разной реакции конъюгатами, не содержащими аденозинового фрагмента (ацетилкоэнзим А имеет 1.5 мкМ [23]), оказались не слишком удачными и фосфинильный аналог (рис. 1), представляющий собой аналог продукта ферментативной реакции, ^-ацетилспермидина, действовал лишь в концентрации 0.1 мМ, т.е. на уровне сродства продукта реакции к ферменту [12].
Изначально аминоокси аналоги Брт и Брё были синтезированы в качестве изостерных зарядоде-фицитных аналогов полиаминов (р^ Н^О-груп-пы ~4—4.5). Они оказались субстратами или ингибиторами ферментов метаболизма полиаминов, ингибиторами их транспорта, а также обладали низкой токсичностью и регулируемой катаболиче-ской устойчивостью (см. обзоры [24, 25]).
Различия в реакционной способности Н^- и Н^—О-групп позволяют рассматривать амино-оксианалоги полиаминов (рис. 2) в качестве удобных строительных блоков. С их помощью нам удалось реализовать простой двухстадийный синтез бисубстратных ингибиторов ББАТ на основе СоАБН (соединения (2)—(5)) и ^-пантетеи-на (соединения (7)—(10) (схема). На первой стадии СоАБН алкилируют хлорацетоном в слабощелочной среде. Реакция проходит быстро и гладко приводит к кетону (1), который вводится в реакцию с соответствующими 0-замещенными гидроксиламинами. Использование 1-аминоок-си-7-амино-3-азагептана (АОЕРШ;) и 1-аминоок-
си-7-амино-4-азагептана (АРАРА), см. рис. 2, позволило получить конъюгаты с коэнзимом А, моделирующие бисубстратные комплексы с участием аминогруппы в первом или восьмом положениях Spd соединения (2) и (3) соответственно. Использование 1 -аминоокси- 3,8 -диаза-11 -аминоунде-кана (AOSpm) и 1-аминоокси-6-амино-3-азаге-скана (нор-AOEPut), см. рис. 2, привело к соединениям (4) и (5), моделирующим бисубстратные комплексы, возникающие при ацетилировании Spm и нор-Spd. Обе стадии синтеза конъюгатов (2)— (5) проходили с выходами близкими к количественным — исходные и побочные продукты не детектировались при помощи ТСХ и ЯМР, что позволило получить эти соединения в количествах, необходимых для проведения ферментативных испытаний и физико-химического анализа, исходя всего лишь из 20 мг CoASH.
Для получения конъюгатов ^-пантетеина (^-Pant) с аминооксианалогами полиаминов на первой стадии дисульфид ^-пантетеина восстанавливали эквивалентным количеством дитио-треитола. Затем, свободные HS-группы алкили-ровали 0.9 эквивалентами хлорацетона и кетон (6) без выделения вводили в реакцию с 0.85 эквивалентами соответствующего О-замещенного гид-роксиламина. Такие соотношения реагентов позволили провести все три реакции без выделения промежуточных соединени
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.