МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 84, № 2, с. 192-203
УДК 575.174.015.3:575.222.7:582.282
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
СТЕРИЛЬНОСТЬ ГИБРИДОВ У ДРОЖЖЕЙ SCHIZOSACCHAROMYCES POMBE: ГЕНЕТИЧЕСКИЙ РОД И МНОЖЕСТВО ВИДОВ IN STATU NASCENDI? © 2015 г. Г. И. Наумов1, В. И. Кондратьева, Е. С. Наумова
Научно-исследовательский центр биолого-медицинских технологий, Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений РАН, Москва Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов,
Москва
Поступила в редакцию 19.03.2014 г.
Обнаружен феномен гибели аскоспор у многочисленных межштаммовых гибридов дрожжей Schizosaccharomycespombe. Тем не менее, у них наблюдалась мейотическая рекомбинация родительских контрольных ауксотрофных маркеров на случайной выборке аскоспор. Представленные генетические и молекулярные данные свидетельствуют, по крайней мере, о географической дивергенции геномов популяций Sch. pombe. Обсуждается классификация рода, видов и разновидностей этих дрожжей.
Ключевые слова: Schizosaccharomyces pombe, гибридизация, филогенетика, RAPD-ПЦР, полиморфизм хромосомных ДНК.
DOI: 10.7868/S0026365615010097
Делящиеся дрожжи Schizosaccharomyces pombe представляют большой интерес для фундаментальных и прикладных исследований [1—3]. По степени генетической и молекулярной изученности эти дрожжи близки к классическому дрожжевому объекту Saccharomyces cerevisiae. Уже два десятилетия тому назад стало ясно, что молекулярный хиатус между этими дрожжами огромен и соответствует не различным родам или семействам, а порядкам [4]. Действительно дрожжи Sch. pombe на филогенетическом древе грибов занимают особое положение [5]. Они, вероятно, представляют собой предковые формы современных аскомицетов. Более того, есть точка зрения, что высшие эукариоты (растения и животные) произошли от этих дрожжей [6, 7]. Подчеркнем, что по многим характеристикам делящиеся дрожжи более, чем почкующиеся сходны с мицелиаль-ными грибами, растениями и животными [8] и в связи с этим представляют лучшую модель для изучения клеток высших эукариот [9].
Дрожжи Sch. pombe активно сбраживают сахара и используются для получения алкогольных напитков преимущественно в странах жаркого климата, а также для снижения кислотности виноградного сусла и вина [10—12].
1 Автор для корреспонденции (e-mail: gnaumov@yahoo.com).
В своем предварительном сообщении [13] мы описали феномен гибели аскоспор у гибридов Sch. pombe. Принимая во внимание наши дополнительные данные [14] по важным штаммам (генетические линии, Sch. kambucha nom. nud.) и имеющиеся новые сведения [15] по большому ка-риотипическому разнообразию природных штаммов Sch. pombe, мы сочли необходимым опубликовать специальную статью об очевидной взаимосвязи феномена гибели аскоспор у меж-штаммовых гибридов и хромосомного полиморфизма Sch. pombe.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Штаммы и среды. Объектами изучения служили одиннадцать штаммов Sch. pombe различного географического происхождения (табл. 1), в основном полученные из Centraalbureau voor Schim-melcultures (CBS), Утрехт, Голландия и генетические линии 972 h- (CBS 7264) и 975 h+ (CBS 7265), полученные нами в 1991 г. из лаборатории H. Heslot (INRA, Париж). Гомоталличный штамм под названием Sch. kambucha (nom. nud.) SPK571 был любезно предоставлен нам A.J.S. Klar (NCI, Frederick, США) [16, 17]. Полную информацию об использованных штаммах CBS можно найти на сайте http://www.cbs.knaw.nl в интернете. Обратим внимание только на происхождение генети-
Таблица 1. Происхождение изучаемых штаммов 8сМ10$асскаготусе$ ротЬе
№ штаммов* в коллекциях
Источник и место выделения
CBS ВКПМ
356T 2576 Коллекция Kral, Африка Sch. pombe Lindner 1893
357T 2587 Патока тростникового сахара, Ямайка Sch. mellacei Jörgensen 1909
1043Т 2588 Патока тростникового сахара, Тайвань Sch. formosensis Nakazawa 1914
1057 2589 Пивные дрожжи, Швеция Sch. pombe
1061T 2590 Патока тростникового сахара, Таити Sch. taito Nakazawa 1914
2628 2591 Пальмовое вино, Пакистан Sch. pombe
5557T 2592 Виноград, Испания Sch. malidevorans Rankine et Fornachon 1964
5680Т 2593 Яблоки, Польша Sch. pombe var. acidodevoratus Dittrich 1964
5682 2594 Пиво Банту, ЮАР Sch. pombe
7264 2595 Виноградный сок, Швейцария Sch. liquefaciens Osterwalder 1924
(972 h-)
7265 2596 Виноградный сок, Швейцария Sch. liquefaciens Osterwalder 1924
(975 h+)
SPK571 - Грибная закваска "Kambucha", Китай Sch. kambucha Singh et Klar (nom. nud.)
Оригинальное название
* Сокращенные названия коллекций: ВКПМ — Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов, Москва; ВКМ — Всероссийская коллекция микроорганизмов, Москва. Культуры CBS 7264 и CBS 7265 происходят от одного и того же штамма CBS 1042T = ВКМ Y-663. Соответствие номеров штаммов из разных коллекций: CBS 356 = ВКМ Y-658, CBS 357 = = ВКМ Y-652, CBS 1042 = ВКМ Y-663, CBS 1061 = ВКМ Y-665. Штамм SPK571 отсутствует в коллекции CBS. T - типовая культура.
ческих линий. Гетероталличные гаплоидные штаммы 972 h- и 975 h+ разных типов спаривания получены [18] от культуры CBS 1042, выделенной из виноградного сока в Швейцарии [19] и первоначально идентифицированной как Sch. liquefaciens Osterwalder. Позднее эти дрожжи были реидентифи-цированны как Sch.pombe [20]. Они широко используются в генетических исследованиях в различных лабораториях мира. Типовой культурой Sch. pombe является штамм CBS 356, происходящий из коллекции Kral в Вене [21].
Дрожжи выращивали при температуре 28°C на полной среде YEA следующего состава (г/л): дрожжевой экстракт — 5, глюкоза — 30, агар — 20. Состав селективной минимальной среды ММА (г/л): глюкоза — 10, раствор солей, витаминов и микроэлементов, агар — 20 [22].
Гибридизационный анализ. Скрещивания проводили на среде SPA (г/л): глюкоза — 10, KH2PO4 — 1, комплекс витаминов, агар — 30 [22]. Для роста и спорообразования при температуре 25°C использовали среду MEA (г/л): солодовый экстракт — 5, глюкоза — 30, агар — 20. Изоляцию аскоспор проводили при помощи иглы микроманипулятора; оболочки асков растворяли пищеварительным соком виноградной улитки (ПСУ) Helix pomatia. Случайную выборку спор получали по методу Le-upold [22]. Спорулирующие культуры обрабатывали ПСУ 6 ч при 28°C и 30%-ным спиртом 30 мин при 18°C. В некоторых случаях время об-
работки было сокращено: 3 ч — ПСУ и 10 мин — 30%-ным спиртом.
Моноспоровые или моноклеточные гаплоидные клоны были маркированы ауксотрофными мутациями с помощью ультрафиолета или нитро-зогуанидина. Штаммы с комплементарными аук-сотрофными мутациями скрещивали на среде SPA при 25°C. Смесь суточных культур помещали на поверхность агара, через 6—14 ч дрожжи переносили на среду ММА, добавляли 2 капли 0.9% NaCl и рассевали газоном. Контроль на реверти-рование к прототрофности осуществляли рассевом родительских ауксотрофных культур на среде ММА в той же концентрации, как и при скрещивании. Изучаемые дрожжи имеют гаплонтный жизненный цикл, они скрещиваются и спорули-руют на одной и той же голодной среде. Поэтому для каждой скрещиваемой пары время экспозиции на среде SPA подбирали, не допуская спору-ляции. Через 2—3 сут выросшие на среде ММА при 28°C прототрофные гибридные колонии дополнительно клонировали на этой же среде, затем переносили штрихом на среду MEA для роста и споруляции и инкубировали при 25°C 2—3 сут. Для гибридов с участием штаммов CBS 1043 и SPK571 время скрещивания на SPA-среде составляло всего 2—3 ч, после этого, сразу клонировали смешанную культуру на среде ММА. Выросшие гибридные колонии спорулировали на этой среде и поэтому подвергались дальнейшему анализу без последующих пересевов. Гомоталлизм выявляли
по изменению окраски колоний, выросших на среде MEA, при экспозиции с йодом [23].
ПЦР-анализ. ДНК дрожжей выделяли с помощью набора Genomic DNA Purification Kit ("Fermentas", Литва). Полимеразную цепную реакцию осуществляли на ДНК-амплификаторе "Терцик™" ("ДНК-технология", Россия). Амплификацию ДНК с RAPD праймерами OPA-01 (5'-CAGGC-CCTTC), 0PA-04 (5'-AATCGGGCTG), 0PA-09 (5'-GGGTAACGCC) и OPA-11 (5'-CAATCGCCGT) проводили в 30 мкл буфера, содержащего 3 мМ MgCl2, 0.3 мМ каждого дНТФ, 50 пмоль каждого праймера, 1.25 ед. акт. Тод-полимеразы ("Синтол", Россия), 20—200 нг анализируемой геномной ДНК. 45 циклов ПЦР осуществляли в режиме: денатурация ДНК — 94°С, 1 мин, отжиг праймера — 36°С, 1 мин, синтез ДНК — 72°С, 2 мин. Разделение ам-плифицированных фрагментов ДНК проводили в 1.2% агарозном геле при 55—60 В в 0.5х ТВЕ буфере в течение 2—3 ч. Гель окрашивали бромистым этидием в течение 1—2 ч, промывали в дистиллированной воде и фотографировали в УФ свете.
Филогенетический анализ. Родство между штаммами устанавливали путем сравнения профилей ПЦР-продуктов, амплифицированных с RAPD праймерами 0PA-01, 0PA-04, 0PA-09 и OPA-11. Дендрограммы, основанные на матрице различий по ПЦР-профилям с указанными праймерами, строили с помощью программы Neighbor-Joining из компьютерного пакета TREECON [24]. Индексы бутстрепа, определяющие статистическую достоверность выделения групп, определяли для 1000 псевдореплик. В качестве внешней группы использовали штамм Saccharomyces cerevisiae S288c.
Пульс-электрофорез хромосомных ДНК. Приготовление препаратов хромосомных ДНК описаны ранее [25]. Образцы помещали в щели 1%-ного агарозного геля. В качестве буфера использовали 0.5х ТВЕ, охлажденный до 14°С. Электрофорез проводили на аппарате CHEF-DR III ("Bio-Rad", США) при 50 В в следующем режиме: 1) 48 ч со временем переключения полей 2400 с, 2) 70 ч со временем переключения полей 3000 с, 3) 24 ч со временем переключения полей 3300 с. После электрофореза гель окрашивали бромистым этидием промывали в дистиллированной воде и фотографировали. В качестве кариотипических стандартов использовали штаммы Saccharomyces cerevisiae YNN 295 и Sch. pombe 972 h- ("Bio-Rad", США), имеющие известные размеры и порядок хромосом.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Генетическое изучение географической коллекции штаммов Sch. pombe из CBS. Споры дрожжей Schizosacchar
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.