ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2015, № 4, с. 376-381
МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 582.232+576.851
СТИМУЛИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ЭКЗОМЕТАБОЛИТОВ МОРСКОЙ МИКРОВОДОРОСЛИ Phaeodactylum tricornutum bohlin НА РАЗМНОЖЕНИЕ Listeria monocytogenes
© 2015 г. А. М. Кривошеева*, Л. С. Бузолева*, **, Н. А. Айздайчер***, Т. А. Кузнецова****
*Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова СО РАМН,
690087 Владивосток, ул. Сельская, 1 **Дальневосточный федеральный университет, 690950 Владивосток, ул. Суханова, 8 ***Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН, 690041 Владивосток, ул. Пальчевского, 17 ****Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, 690022 Владивосток, просп. 100 лет Владивостоку, 159 E-mail: an_gel_us@mail.ru Поступила в редакцию 07.07.2014 г.
Изучена биологическая активность этилацетатного экстракта экзометаболитов морской микроводоросли Phaeodactylum tricornutum на тестовую культуру Listeria monocytogenes 4b. Установлено, что стимулирующее действие экзометаболитов водоросли на рост патогенных бактерий усиливается максимально на 98.3% на 6-е сут культивирования, если для разделения активных веществ, входящих в состав культуральной жидкости P. tricornutum, использовали последовательную экстракцию растворителями в порядке возрастания их полярности (гексан, бензол, этилацетат), и на 150% на 3-и сут, если применяли колоночную хроматографию для разделения веществ этилацетатного экстракта экзометаболитов. Отмечено, что фракция биологически активных веществ, максимально стимулирующих рост L. monocytogenes, может быть использована для приготовления среды накопления в целях выявления этих патогенных бактерий из морской среды и гидробионтов.
DOI: 10.7868/S0002332915040086
Водная среда — одно из мест обитания некоторых видов патогенных микроорганизмов, в том числе и Listeria monocytogenes (Литвин и др., 1998; Сомов, Бузолева, 2004). Их обнаруживают в загрязненных стоками озерах, реках, в прибрежной зоне морских заливов, в донных отложениях, льдах и различных гидробионтах (Беленева, Быстрова, 1997; Iida et al, 1998; Бузолева, Терехова, 2002; Терехова и др. 2010; Montaz, Yado-llah, 2013).
Начиная с конца 1980-х гг. в ряде стран Европы и Америки были отмечены многочисленные вспышки листериоза у людей, связанные с употреблением в пищу инфицированных морских продуктов. Это стало основанием для организации эпидемического надзора и бактериологического обследования морепродуктов на присутствие L. monocytogenes в большинстве стран мира. Обнаружение L. monocytogenes в образцах, отобранных из морской среды, усложняется следующими обстоятельствами: пониженной жизнеспособностью клеток L. monocytogenes, низкой скоростью их размножения, присутствием посторонней
микрофлоры, превышающей численность листе-рий на несколько порядков (Мухина и др., 2003). В связи с этим проблема изоляции штаммов ли-стериозного микроба из морской среды достаточно актуальна.
Для увеличения количества листерий в исследуемых образцах сейчас используют способ накопления культуры возбудителя на средах обогащения (одно- или двухступенчатое обогащение с различными селективными добавками) (Мухина и др., 2003). Для более полного выявления и учета популяций листерий, обитающих в морской среде, нами предложен способ накопления листери-озного микроба (L. monocytogenes) в минеральной среде, содержащей стерильную морскую воду (Терехова и др., 2006). Это позволяет изолировать штаммы L. monocytogenes из морской среды в неизмененном (природном) виде при использовании адаптированной среды обогащения. Главный недостаток этого способа — его длительность (14 сут). Ускорить процесс обогащения культуры L. monocytogenes могут стимуляторы роста из морской среды.
СТИМУЛИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ЭКЗОМЕТАБОЛИТОВ
377
Важный аспект обитания L. monocytogenes в морской среде — их взаимоотношение с микроводорослями (Сомов и др., 2001), обитающими в тех же местах. Метаболические взаимоотношения между микроорганизмами и микроводорослями в альгобактериальных сообществах могут быть разнообразными. Известно, что водоросли в процессе своего развития образуют соединения, обладающие биологической активностью, которые, поступая в окружающую среду, могут стимулировать или угнетать развитие сопутствующей микрофлоры (Батуро и др., 2001; Мусатенко, 2001). Биологическая активность экзометаболитов водорослей зависит от видовой принадлежности водоросли и стадии развития альгокультуры.
Ранее нами было установлено, что экзометабо-литы стационарной фазы роста микроводорослей оказывали явное стимулирующее действие на размножение L. monocytogenes в искусственной и естественной морских водах (Бузолева, Терехова, 2002; Бузолева и др., 2010). Показано, что из взятых в эксперимент микроводорослей (Рhaeodacty-lum tricornutum, Chlorella minutissima и Chroomonas salina) этилацетатная фракция экзометаболитов микроводоросли Р. tricornutum, культивируемой в естественной морской воде, отобранной летом, обладает наибольшим стимулирующим действием на рост тест-микроорганизмов (L. monocytogenes 4b, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimuri-um) (Бузолева и др., 2010).
Цель исследования — подбор наиболее оптимального метода получения биологически активной фракции экзометаболитов морской микроводоросли Р. tricornutum, оказывающей стимулирующее влияние на рост L. monocytogenes.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования была альгологически чистая культура морской микроводоросли P. tricornutum Bohlin, полученная из коллекции Института биологии моря ДВО РАН (Владивосток). В качестве тест-культуры использовали штамм L. monocytogenes 4b серовариант (коллекция ВГНКИ ветеринарных препаратов), типичный по своим культурально-морфологическим, биохимическим и антигенным свойствам.
Клетки микроводоросли Р. tricornutum культивировали в модифицированной среде Гольдберга (Кабанова, 1961), приготовленной на природной морской воде соленостью 32%о, отобранной в начале июля в бух. Лазурной Уссурийского зал. и профильтрованной через стерильную фильтрующую насадку Millex с диаметром пор 0.22 мкм (Millipore, США).
Культивирование штамма L. monocytogenes 4b проводили в жидкой минеральной среде Патерсона-Кука (Paterson, Cook, 1963) (pH 7.2-7.4) с0.1%-ной глюкозой и экзометаболитами (40 мкг/мл).
Клетки Р. tricornutum культивировали при 20-22°С и светотемновом режиме 12 ч : 12 ч при освещении люминесцентными лампами 3500 лк в течение 15 сут. Исходная концентрация клеток составляла 2-5 х 104, в конце опыта — 1100-1300 х х 104 кл./мл.
Клетки микроводоросли отделяли от культу-ральной жидкости (КЖ) центрифугированием при 6000 об./мин, используя центрифугу марки ЦЛС-3 (Россия), КЖ фильтровали с использованием фильтрующей насадки Millex с диаметром пор 0.22 мкм (Millipore). Экзометаболиты (ЭМ) микроводоросли Р. tricornutum получали последовательной экстракцией КЖ растворителями в порядке возрастания их полярности (гексан, бензол, этилацетат, ч. д. а.) для частичного разделения веществ (Тамбиев и др., 1981). Растворители удаляли на роторном испарителе RVO 64 (MIK-ROTECHNA, Чехословакия) при температуре не выше 40°С и высушивали в вакуумном эксикаторе над осушителем (силикагель) при комнатной температуре до постоянного веса.
Были выделены экзометаболиты: гексановая фракция (ГФ), бензольная фракция (БФ) и этил-ацетатная фракция (ЭАФ) КЖ. Прямой экстракцией этилацетатом КЖ, взятой в стационарной фазе роста (Терехова и др., 2001), получили этил-ацетатный экстракт (ЭАЭ) КЖ. Вещества ЭАЭ КЖ дополнительно разделяли на колонке с сили-кагелем (40-63 мкм) с использованием растворителей (гексан, этилацетатметанол, метанол). В результате получили четыре фракции ЭМ (фр. 1-4).
Метаболиты (ГФ, БФ и ЭАФ КЖ; ЭАЭ КЖ; фр. 1-4 ЭАЭ КЖ) вносили в среду Патерсона-Кука с 0.1%-ной глюкозой для культивирования листерий, культуру которых вносили в концентрации ОП600 = 0.1, где ОП600 - оптическая плотность (ОП) культуральной среды при X = 600 нм. Исследовали динамику роста L. monocytogenes 4b в опытных средах, содержащих ЭМ, полученные согласно описанным выше методикам. Контрольные среды отличались от опытных только тем, что вместо ЭМ микроводоросли Р. tricornutum использовали аналогичные экстракты и фракции, полученные в результате экстракции среды, содержащей стерильную природную морскую воду, и фракции органических веществ, полученные колоночной хроматографией ЭАЭ природной морской воды.
378
КРИВОШЕЕВА и др.
Изучение динамики роста штамма L. monocytogenes 4b в среде Патерсона—Кука (pH 7.2—7.4) с 0.1%-ной глюкозой и ЭМ проводили при периодическом культивировании в течение 13—14 сут при 20—22°С. Численность бактерий определяли спектрофотометрически по ОП600 на спектрофотометрах СФ-46 (ЛОМО, Россия) и T70 UV/VlS (PG Instruments Ltd, Англия).
Биологическую активность ЭМ микроводоросли Р. tricornutum определяли по изменению ОП культуральной среды штамма L. monocytogenes 4b, выраженному в процентах по отношению к контролю: (ОПо00/ОПк00 х 100%) - 100%. Контроль принимали за 100%; ОПо и ОПк — оптические плотности соответственно опытной и контрольной культур; повторность опытов трехкратная.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Биологическую активность ГФ, БФ и ЭАФ КЖ; ЭАЭ КЖ; фр.1—4 ЭАЭ КЖ определяли согласно вышеописанным методикам. Результаты экспериментов представлены в таблице.
Стимулирующее действие экзометаболитов ЭАЭ КЖ на рост L. monocytogenes 4b наблюдали в течение всего эксперимента (14 сут), однако на 1—3-и сут оно было незначительным (10.9— 19.2%), а на 6-е сут культивирования бактерий — максимальным, и прирост биомассы листерий был на 28.9% выше контроля (таблица).
Экстракция КЖ, полученной при культивировании микроводоросли в морской воде, этилаце-татом позволяет выделить широкий спектр органических веществ, входящих в состав как природной морской воды (пектиновые, гумусовые, белковые вещества (аминокислоты), углеводы, различные жирные кислоты, ферменты, ростовые вещества, антибиотики и витамины), так и внеклеточных соединений, поступающих в среду в процессе жизнедеятельности активно растущей культуры Р. tricornutum.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.