ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2009, том 424, № 2, с. 270-272
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 572.788:577.151.6
СТИМУЛЯЦИЯ АДЕНИЛАТЦИКЛАЗЫ ЦИКЛИЧЕСКИМ АДЕНОЗИНМОНОФОСФАТОМ В КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЕ ИНФУЗОРИИ БХЬЕРТШ Л^ЕИ
© 2009 г. А. О. Шпаков, К. В. Деркач, 3. И. Успенская, М. Н. Перцева
Представлено академиком В.Л. Свидерским 04.05.2008 г. Поступило 04.05.2008 г.
Циклический аденозинмонофосфат (цАМФ), продукт реакции циклизации АТФ, катализируемой ферментом аденилатциклазой (АЦ). Он является важнейшим вторичным посредником, активирующим протеинкиназу А и широкий спектр цАМФ-зависимых сигнальных каскадов у высших и низших эукариот, и контролирует, таким образом, фундаментальные клеточные процессы -метаболизм, рост, дифференцирование, апоптоз. Однако у амебы Б1с1уо81е1шт Шзсо1ёеит и гриба №иго8рога сивва цАМФ является не только вторичным, но и первичным посредником, который секретируется во внеклеточное пространство и выполняет функцию гормоноподобного вещества - хемоаттрактанта [1, 2]. У этих одноклеточных организмов внеклеточный цАМФ специфически связывается с поверхностными рецепторами (цАМФ-рецепторами), которые относятся к рецепторам серпантинного типа. Через посредство гетеротримерных в-белков он регулирует множество внутриклеточных эффекторных систем, в том числе цАМФ-зависимых, контролируя хемотаксис и агрегацию индивидуальных клеток в многоклеточные образования. Уникальность ситуации заключается в том, что одной из основных мишеней действия внеклеточного цАМФ является АЦ, которая осуществляет его синтез внутри клетки. Изучение механизмов цАМФ-за-висимого хемотаксиса необходимо для понимания молекулярных основ фагоцитарной активности лимфоцитов, направленного движения сперматозоидов и других процессов, определяющих жизненно важные функции человека и высших позвоночных животных [3, 4].
В настоящее время сведения о способности цАМФ стимулировать активность хемосигналь-ных систем ограничиваются амебой Б. Шзсо1ёеит и грибом N. сгавва. Однако проведенный нами анализ геномов показал, что гены, кодирующие рецепторы, гомологичные цАМФ-рецепторам
Институт эволюционной физиологии и
биохимии им. И.М. Сеченова
Российской Академии наук, Санкт-Петербург
D. discoideum и N. crassa, имеются и у других представителей низших эукариот - грибов (Aspergillus terreus, Aspergillus clavatus, Gibberella zeae и др.), инфузорий (Tetrahymena thermophila, Paramecium tetraurelia) и амебы Polysphondylium pallidum. При этом в геноме T. thermophila обнаружены, по крайней мере, четыре таких рецептора. Это указывает на то, что цАМФ-рецепторы имеют гораздо большее распространение среди одноклеточных организмов, чем предполагалось ранее. Нельзя исключить присутствия рецепторов, способных связываться с цАМФ, и у позвоночных животных. Так, проведенный нами анализ обнаружил гомологию между цАМФ-рецепторами одноклеточных, с одной стороны, и орфановыми рецепторами (GPR98, GPR123, GPR125, GPR126, GPR128, GPR133, GPR143 и GPR157) и Frizzled-рецепторами млекопитающих, с другой, причем наиболее отчетливо структурное сходство между ними было выражено в области цАМФ-связывающего сайта.
Цель настоящей работы состояла в изучении влияния цАМФ на активность аденилатциклазной системы (АЦС) в клеточной культуре свободно-живущей инфузории Dileptus anser и выяснении молекулярных механизмов регуляторного действия этого циклического нуклеотида. Ранее нами было обнаружено, что негормональные активаторы АЦ (фторид натрия, гуаниновые нуклеотиды) и некоторые гормоны позвоночных (биогенные амины, глюкагон, пептиды инсулинового суперсемейства) влияют на активность компонентов АЦС у этой инфузории и их действие реализуется через посредство гетеротримерных G-белков [5-8].
Объектами исследования служили инфузории D. anser с плотностью культуры 140-150 клеток/мл, которых культивировали, как описано ранее [5]. Клетки осаждали центрифугированием, трижды отмывали 20 мМ трис-НО-буфером (pH 7.5), ресус-пендировали в концентрации 5 ■ 105 клеток/мл и использовали для связывания с меченым цАМФ. Связывание проводили в 20 мМ трис-НСЬбуфере (pH 7.5), который содержал 5 мМ кофеина и 10 мМ DTT для подавления синтеза и деградации цАМФ соответственно. Для связывания брали
СТИМУЛЯЦИЯ АДЕНИЛАТЦИКЛАЗЫ
271
100 мкл клеток и инкубировали их с различными концентрациями [8-3И]цАМФ (1—100 нМ) (NEN Life Science Products Inc.) в течение 30 мин при 25°С, затем инкубационную смесь помещали на фильтры GF/B, которые трижды промывали трис-НС1-буфе-ром (по 5 мл), высушивали, помещали в виалы со сцинтилляционной смесью и измеряли радиоактивность на счетчике Rackbeta ("LKB", Швеция). Значения специфического связывания [8-3Н]цАМФ рассчитывали вычитанием неспецифического связывания [8-3Н]цАМФ, измеренного в присутствии 10-4 M немеченного цАМФ, из общего связывания [8-3Н]цАМФ. Для расчета числа связывающих мест (Bmax) и значения константы диссоциации (Kd) для цАМФ кривые насыщения преобразовывали по методу Скэтчарда.
Определение уровня ГТФ-связывания G-бел-ков в гомогенатах клеточных культур инфузории D. anser проводили, как описано ранее [7]. Уровень ГТФ-связывания выражали в пмоль [8-3Н]-гуанилилимидодифосфата ([8-3H]-GppNHp) на 1 мг белка. Активность АЦ (EC 4.6.1.1) в гомогена-те определяли по методу [9] с модификациями. Ферментативную реакцию проводили при 30°С и времени инкубации 10 мин в инкубационной среде следующего состава: 50 мМ трис-НС1, рН 7.5, 0.1 мМ АТФ, 20 мМ креатинфосфата, 0.2-0.5 мг/мл креат-инфосфокиназы, 5 мМ MgCl2, [а-32Ф]АТФ добавляли из расчета 1-2 мкКи на пробу. Активность АЦ выражали в пмоль цАМФ за 1 мин на 1 мг белка.
В ходе исследования специфического связывания цАМФ с клетками D. anser в условиях in vivo была получена кривая насыщения, анализ которой и ее преобразование по Скэтчарду позволили рассчитать значения Kd (27 нМ) и Bmax (2.65 фмоль цАМФ на 50000 клеток), рис. 1. В пересчете на одну клетку D. anser число связывающих мест, являющихся, как мы полагаем, цАМФ-рецептора-ми, составило 4500, что примерно на порядок меньше числа цАМФ-рецепторов у амебы D. dis-coideum на стадии агрегации этих одноклеточных организмов в многоклеточное образование [10]. Следует отметить, что уровень неспецифического связывания, который определяли в присутствии 10-4 М цАМФ, был сравнительно высоким и составлял 40-50% от общего связывания.
Базальная активность АЦ в гомогенате клеток D. anser составляла 985 ± 75 пмоль цАМФ за 1 мин на 1 мг белка. цАМФ в диапазоне концентраций 10-7—10-3 М отчетливо стимулировал активность фермента со значением EC50, равным 2 мкМ (рис. 2а). Стимулирующий эффект циклического нуклеотида достигал максимума при его концентрации 10-4 М и в дальнейшем снижался. цАМФ также дозозависимо стимулировал ГТФ-связыва-ние, которое является показателем функциональной активности G-белков (базальный уровень ГТФ-связывания в гомогенате D. anser составлял
Связывание [3Н]цАМФ, фмоль/50000 кл.
[3Н]цАМФ, нм Связанный/свободный [3Н]цАМФ, х 10-6
Связанный [3И]цАМФ, фмоль/50000 кл.
Рис. 1. Специфическое связывание [8-3И]цАМФ с клетками инфузории D. anser в условиях in vivo (а) и преобразование кривой насыщения в координатах Скэтчарда (б).
0.37 ± 0.04 пмоль [8-3H]-GppNHp на 1 мг белка), рис. 26. Однако форма кривой доза-эффект в этом случае отличалась от таковой, полученной для активации АЦ циклическим нуклеотидом, что выражалось в усилении стимулирующего эффекта цАМФ на ГТФ-связывание при повышении его концентрации с 10-4 М до 10-3 М. Одним из объяснений выявленных различий может являться стимуляция высокими концентрациями цАМФ ГТФ-связывания G-белков, ингибирую-щим образом сопряженных с АЦ.
Обнаружено также, что в присутствии GppNHp, негидролизуемого аналога ГТФ, действие цАМФ на активность АЦ усиливается (потенцируется). Потенцирование стимулирующего АЦ эффекта 10-4 М цАМФ в присутствии 10-5 М GppNHp составляло 31%. В присутствии сурамина (10-5 М), специфичного ингибитора гетеротримерных G-белков, не влияющего на мономерные их формы (малые G-белки), стимуляция циклическим нуклеотидом АЦ полностью подавлялась. Таким образом, стимуляция
ШПАКОВ и др.
272
Активность АЦ, %
Рис. 2. Стимулирующее влияние цАМФ на активность АЦ (а) и уровень ГТФ-связывания G-белков (б) в культуре клеток D. anser. Активность АЦ и уровень ГТФ-связывания в отсутствие цАМФ приняты за 100%.
Структурно близкие цАМФ пуриновые нук-леотиды (АМФ, ГМФ, цГМФ) и аденозин, взятые в концентрации 10-4 М, практически не влияли на базальную и стимулированную цАМФ активность АЦ. К6,02'-дибутирил-цАМФ, негидролизу-емый аналог цАМФ, только в сравнительно высоких концентрациях 10-4 и 10-3 М оказывал заметный эффект на активность АЦ (стимуляция на 32 и 70%) и уровень ГТФ-связывания (повышение на 14 и 26%) и незначительно снижал стимулирующие АЦ эффекты цАМФ (данные не представлены). Полученные результаты, с одной стороны, указывают на высокую специфичность регулятор-ного действия цАМФ на компоненты АЦС, что, как мы полагаем, определяется структурой ли-гандсвязывающего сайта сопряженных с АЦ и G-белками цАМФ-рецепторов инфузории, и, с другой, свидетельствуют об отсутствии влияния на цАМФ-зависимые сигнальные пути других пу-риновых нуклеотидов.
Таким образом, впервые показано, что АЦС свободноживущих инфузорий D. anser чувствительна к внеклеточному цАМФ, который специфично связывается с поверхностными рецепторами и реализует свое регуляторное влияние на АЦ через посредство гетеротримерных G-белков. Полученные данные свидетельствуют о том, что цАМФ не только является важнейшим внутриклеточным регулятором цАМФ-зависимых сигнальных каскадов, но и выполняет функцию внеклеточного сигнала, по крайней мере у некоторых представителей одноклеточных эукариот.
Работа поддержана РФФИ (проект 06-04-48809) и "Фондом содействия отечественной науке".
циклическим нуклеотидом активности АЦ и ГТФ-связывания G-белков, а также потенцирование АЦ-эффекта цАМФ в присутствии GppNHp и его инги-бирование в присутствии сурамина свидетельствуют о том, что цАМФ реализует свое регуляторное влияние на АЦ через сигнальную цепь, включающу
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.