МИКРОБИОЛОГИЯ, 2012, том 81, № 2, с. 282-285
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 579.8.043
СТИМУЛЯЦИЯ АНТИБИОТИКАМИ ПРОЦЕССА ФОРМИРОВАНИЯ
БАКТЕРИАЛЬНЫХ БИОПЛЕНОК
© 2012 г. Е. А. Стрелкова, М. В. Журина, В. К. Плакунов1, С. С. Беляев
Учреждение Российской академии наук Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва Поступила в редакцию 20.06.2011 г.
Биопленки, формируемые патогенными микроорганизмами, являются причиной ряда хронических инфекций, которые не поддаются лечению антибиотиками [1]. Они затрудняют использование внедряемых в макроорганизм медицинских аппаратов и других приспособлений типа катетеров, искусственных клапанов и других [2—4]. Биопленки также служат одним из важнейших агентов, вызывающих биокоррозию трубопроводов и технологического оборудования. Борьба с устойчивостью бактериальных биопленок к физико-химических воздействиям, биоцидам и антибиотикам является одной из главных проблем современной медицины и промышленности.
В последнее время обнаружено еще одно явление, затрудняющее борьбу с биопленками. Оказалось, что некоторые вещества, образуемые растениями [5], а также ряд антибиотиков в суббакте-риостатических концентрациях не только не подавляют рост биопленок, но даже стимулируют его.
Так, например, аминогликозидный антибиотик тобрамицин в субингибиторных концентрациях индуцирует образование биопленок у Pseudomonas aeruginosa и Escherichia coli [6]. Аналогичный эффект вызывает имипенем (бета-лактам-ный антибиотик широкого спектра действия) [7].
Нами предложено использовать антибиотики с разным механизмом действия (азитромицин, рифампицин и оксациллин) в качестве молекулярных инструментов для изучения этапов формирования биопленок непатогенными бактериями, а именно для выявления ключевых процессов метаболизма, приводящих к формированию "биопленочного фенотипа", т.е. к избирательной экспрессии генов, участвующих в формировании биопленок. Оказалось, что некоторые из этих антимикробных агентов могут стимулировать образование биопленок [8].
В настоящей работе подробно изучена сравнительная чувствительность к антибиотикам с разным механизмом действия планктонных (суспен-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: plakunov@inmi. host.ru).
зионных) культур и моновидовых биопленок на разных этапах их формирования у непатогенных микроорганизмов, изолированных из Ромашкин-ского нефтяного месторождения: Dietzia Бр. и Ко-сыпа Бр.
Чувствительность планктонной культуры к антибиотикам характеризовали концентрацией антибиотика, подавляющей на 50% скорость роста культуры (ИД50) (через 24 ч инкубации при 28°С) в пробирках на качалке (150 об/мин) или в ячейках 96-луночного полистирольного планшета (по сравнению со скоростью роста в контроле без антибиотика). Чувствительность биопленок характеризовали тем же показателем, определяемым двумя способами. Первый (классический) способ основан на выращивании биопленок в ячейках 96-луночного планшета с последующим отделением планктонных клеток, окрашиванием биопленок раствором генцианвиолета или кристаллического фиолетового, экстракцией красителя 96% этанолом и измерении оптической плотности полученного раствора при 590 нм [7]. Во втором, модифицированном нами методе, формирование биопленок осуществляли на гидрофобном носителе [9], в качестве которого использовали блочки тефлона, размером 2 х 2 х х 2 мм. Оба метода дают сходные результаты, однако второй характеризуется меньшей вариабельностью. "Предформированными" биопленками мы называли биопленки, инкубированные 24 часа в тех же условиях до внесения антибиотиков. Для окраски матрикса биопленок использовали краситель альциановый синий, взаимодействующий с кислыми полисахаридами матрикса и слабо окрашивающий бактериальные клетки [10]. В этом случае экстракцию красителя осуществляли диметилсульфоксидом, а измерение оптической плотности проводили при 540 нм.
На рисунках и в таблице представлены данные типичных опытов.
Обобщенные результаты чувствительности планктонных культур и биопленок изучаемых бактерий к трем антибиотикам представлены в таблице. Можно видеть, что рост биопленок зна-
Чувствительность к антибиотикам (ИД-50, мкг/мл) изучаемых культур бактерий
Бактерии Культура Антибиотик
Оксациллин Рифампицин Азитромицин
Планктонная(пробирки) 0.0025-0.005 0.0015-0.003 0.02-0.025
Коеыпа 8р. Планктонная (планшеты) 0.005-0.01 0.0015-0.003 0.02-0.05
Биопленки (формирующиеся) 2.5-5.0 0.75-1.0 >1.0
Биопленки (предформированные) >10 >2.0 >10
Dietzia 8р. Планктонная (пробирки) 0.5-1.0 0.03-0.06 0.5-1.0
Планктонная (планшеты) 0.5-1.0 0.05-0.1 0.5-1.0
Биопленки (формирующиеся) 25-50 >2.0 >5.0
Биопленки (предформированные) >125 >5.0 >50
чительно (в десятки и сотни раз) менее чувствителен к изучаемым антибиотикам, чем рост планктонных культур, особенно в случае предформиро-ванных биопленок.
Поскольку формирование биопленок приводит к снижению чувствительности входящих в них микроорганизмов к стрессовым факторам и антибиотикам по сравнению с планктонными культурами, добавление антибиотиков в динамике формирования биопленок позоляет установить момент проявления "биопленочного фенотипа", т.е. определить время, необходимое для перехода клеток от планктонного способа существования к биопленочному (при наличии по-
верхности раздела фаз). С этой целью антибиотики вносили (в лунки планшетов или в пробирки с носителем) одновременно с клеточной суспензией Коеыпа 8р. (нулевой момент), а также через 2, 4, 6 и 14 ч инкубации в термостате. Результаты оценивали через 24 ч. Данные для азитромицина представлены на рис. 1. В случае Б1в111а 8р. антибиотики вносили через 0, 2, 4, 6, и 24 ч. Результаты, которые в этом случае оценивали через 48 ч (в связи с меньшей скоростью формирования биопленки данным микроорганизмом), представлены на рис. 2. Аналогичные данные получены для оксациллина и рифампицина (не показано).
% от контроля без антибиотика 100 г
90 80 70 60 50 40
2 4 6 8 10 12 14 Время внесения азитромицина, ч
16
% от контроля без антибиотика 90
80
70
60
50
40
30 1
0
2 4 6 20
Время внесения азитромицина, ч
25
0
Рис. 1. Зависимость чувствительности Коеыпа 8р. к азитромицину (0.05 мкг/мл для планктонной культуры и 1 мкг/мл для формирующейся биопленки) от времени внесения антибиотика: 1 - планктонная культура; 2 - биопленка (по окрашиванию кристаллическим фиолетовым); 3 - биопленка (по окрашиванию альциановым синим).
Рис. 2. Зависимость чувствительности Dietzia 8р. к азитромицину (0.5 мкг/мл для планктонной культуры и 5 мкг/мл для формирующейся биопленки) от времени внесения антибиотика: 1 - планктонная культура; 2 - биопленка (по окрашиванию кристаллическим фиолетовым); 3 - биопленка (по окрашиванию альциановым синим).
284
СТРЕЛКОВА и др.
% от контроля без антибиотика 350
300
250
200
150
100
50
0 0.001 0.002 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
Концентрация азитромицина, мкг/мл
Рис. 3. Стимуляция формирования биопленки Коси-па 8р. суббактериостатическими концентрациями азитромицина: 1 — по окрашиванию кристаллическим фиолетовым; 2 — по окрашиванию альциано-вым синим.
% от контроля без антибиотика 240
220
200
180
160
140
120
100
80
60
40
_I_
0 0.02 0.06 0.10 1 2 3 4 5 Концентрация азитромицина, мкг/мл
Рис. 4. Стимуляция формирования биопленки Dietzia 8р. суббактериостатическими концентрациями азитромицина: 1 — по окрашиванию кристаллическим фиолетовым; 2 — по окрашиванию альциановым синим.
В опытах с биопленочными культурами Коси-па Бр. существенное понижение чувствительности к азитромицину наблюдается в период между 2 и 4 ч (рис. 1, кривые 2 и 3), а для культуры Dietzia Бр. — после несколько более длительной инкубации (между 4 и 6 ч) (рис. 2, кривые 2 и 3). Параллельное измерение чувствительности планктонных культур показало отсутствие заметного увеличения устойчивости при добавлении азитромицина в первые (2—6) часы инкубации (рис. 1 и 2, кривые 1). Этот факт исключает возможность влияния плотности микробной популяции или разложения антибиотика в процессе инкубации на величину чувствительности к нему бактерий.
Можно полагать, что именно в указанный период времени (между 2 и 6 ч) в биопленочной культуре происходит переход от обратимой стадии адгезии клеток к необратимой стадии и началу формирования внеклеточного матрикса биопленки.
Для уточнения этого вывода параллельно и независимо от окрашивания биопленок кристаллическим фиолетовым производили их окрашивание альциановым синим. Резкое возрастание окрашивания матрикса в этом случае наблюдалось параллельно с увеличением устойчивости к антибиотикам (рис. 1 и 2, кривые 3), что подтверждает высказанное предположение.
Ранее мы отмечали, что низкие, суббакте-риостатические концентрации некоторых антибиотиков стимулируют образование биопленок [8]. В настоящей работе это явление было исследовано подробнее. Антибиотики в широком диа-
пазоне концентраций вносили одновременно с инокулятом микроорганизма или после предварительной инкубации биопленочной культуры в течение 4—6 ч. Далее методом окрашивания кристаллическим фиолетовым и альциановым синим прослеживали рост культуры и формирование матрикса в течение последующих 24 ч инкубации. Результаты для азитромицина представлены на рисунках 3 и 4. Можно видеть, что антибиотик в низких концентрациях (слабо или совсем не подавляющих рост ни биопленок, ни планктонных культур изучаемых микроорганизмов) вызывает заметную стимуляцию биопленкообразования. При этом скорость роста матрикса (по окрашиванию альциановым синим) (рис. 3 и 4, кривая 2) несколько превышает размножение микробных клеток (по окрашиванию кристаллическим фиолетовым) (рис. 3 и 4, кривая 1). Аналогичный эффект вызывает рифампицин, тогда как для окса-циллина это явление не обнаружено. Добавление азитромицина и рифампицина после завершения этапа обратимой адгезии (через 4—6 ч) приводило к снижению или отсутствию эффекта стимуляции биопленкообразования (не показано).
Механизм стимулирующего действия антибиотиков на формирование биопленок остается неизвестным. Высказано предположение, что ан-тибиотики-аминогликозиды могут влиять на уровень
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.