ОНТОГЕНЕЗ, 2012, том 43, № 3, с. 185-192
= ГАМЕТОГЕНЕЗ
УДК 591.465.12
СТИМУЛЯЦИЯ in vitro ОВУЛЯЦИИ ООЦИТОВ ОСЕТРОВЫХ РЫБ ПРОГЕСТЕРОНОМ И ГОМОЛОГИЧНЫМ ГОНАДОТРОПНЫМ
ГОРМОНОМ ГИПОФИЗА
© 2012 г. М. Н. Скоблина, Б. Ф. Гончаров
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 119334 Москва, ул. Вавилова, д. 26 E-mail: skoblina38@mail.ru Поступила в редакцию 04.03.11 г. Окончательный вариант получен 20.05.11 г.
Показано, что процент ооцитов осетровых рыб, овулирующих in vitro в модифицированном для осетровых рыб растворе Рингера (РМО), существенно зависит от концентрации бикарбоната натрия и концентрации прогестерона. В оптимальных условиях (0.5 г/л бикарбоната натрия и 30 нг/мл прогестерона) он может быть выше 80. Созревшие и овулировавшие в таких условиях ооциты способны к нормальному развитию. В наилучшем случае около 70% развивающихся зародышей (от числа овулировавших ооцитов) достигают стадии вылупления (предельный срок наблюдения). Этот метод получения потомства, основанный на осеменении созревших и овулировавших in vitro ооци-тов, может быть использован при работе с единичными самками редких и исчезающих видов осетровых рыб.
Ключевые слова: осетровые рыбы, созревание ооцитов, овуляция in vitro, среда культивирования, бикарбонат натрия, прогестерон, гонадотропный гормон гипофиза.
Созревание ооцитов амфибий и рыб под влиянием гормонов хорошо воспроизводится in vitro (Masui, Clarke, 1979; Goetz, 1983; Гончаров и др., 1997) Изучению механизмов процесса созревания посвящено немало работ (Nagahama, Yamashita, 2008; D'Inca et al., 2010; Pang, Thomas, 2010; Sadler et al., 2010). Гораздо труднее оказалось индуцировать in vitro овуляцию ооцитов (Wallace, Selman, 1978; Goetz, 1983; Pinter, Thomas, 1999; Patino et al., 2003), ее механизмы изучены значительно хуже, хотя и в этом отношении в последнее время достигнуты определенные успехи (Patino et al., 2003; Lister, Van Der Kraak, 2008; Sena, Liu, 2008; Bobe et al., 2009; Dhillon, Liu, 2010).
Изучение овуляции у осетровых рыб до недавнего времени было практически невозможно, так как исследователям либо вовсе не удавалось стимулировать этот процесс in vitro (Lutes, 1985), либо процент овулирующих ооцитов был очень низким, либо результат существенно варьировал от опыта к опыту. Изучение влияния состава среды культивирования овариальных фолликулов на овуляцию ооцитов севрюги показало, что одним из факторов, влияющих на результат гормональной стимуляции in vitro, является осмоляльность среды. Процент ооцитов севрюги, овулирующих in vitro под влиянием экстракта гипофизов осетровых рыб или прогестерона, увеличивался при
разведении среды культивирования (Goncharov et al., 2009). В качестве исходных сред в этой работе были использованы модифицированный для осетровых рыб раствор Рингера для холоднокровных (РМО) (Гончаров, 1978) и среда Лейбовитца (L-15) с добавлением бикарбоната натрия. Разбавление этих сред позволяло получать довольно высокий и сопоставимый в двух средах процент овулирующих ооцитов. Проверка способности к развитию показала, что наилучшей является разведенная до 69% среда L-15, содержащая 1.84 г/л бикарбоната натрия. Тем не менее, и в этой среде овуляцию ооцитов in vitro удалось получить далеко не у всех самок, поэтому представлялось целесообразным продолжить поиск оптимальной среды.
Ранее Гончаровым с соавторами (1997) было показано, что процент ооцитов, созревающих in vitro под влиянием экстракта гипофизов осетровых рыб, возрастает при увеличении осмоляль-ности среды культивирования. При этом оказалось, что для стимуляции созревания среды с увеличенной концентрацией бикарбоната натрия более эффективны, чем среды с большей осмо-ляльностью, но меньшим содержанием бикарбоната. В отношении влияния концентрации бикарбоната натрия на гормональную индукцию овуляции были лишь отдельные наблюдения, ко-
торые и подтолкнули нас к изучению этого вопроса.
Для получения высокого процента созревших, овулировавших и способных к оплодотворению и развитию яйцеклеток важны не только условия инкубирования, но и использование оптимальной гормональной обработки. Известно, что овуляцию ооцитов осетровых рыб индуцируют гона-дотропный гормон гипофиза и прогестерон. Есть все основания предполагать, что в индукции их овуляции принимают участие простагландины, как это показано для бесхвостых амфибий (Schuetz, 1986; Chang et al., 1995; Sena, Liu, 2008), костистых рыб (Goetz et al., 1989; Goetz, Garczyn-ski, 1997; Lister, Van Der Kraak, 2008) и млекопитающих (Hedin et al., 1987; Bridges et al., 2006; Kurusu et al., 2009),
Ключевым ферментом, превращающим ара-хидоновую кислоту в простагландины, является простагландин синтаза или индуцибельная изо-форма циклоксигеназы (ЦОГ-2) (Vane et al., 1998). Показано, что в процессе индукции in vitro созревания и овуляции ооцитов шпорцевой лягушки прогестероном и хорионическим гонадо-тропином человека происходит увеличение экспрессии мРНК ЦОГ-2 (Sena, Liu, 2008). Полученные на млекопитающих данные свидетельствуют о том, что активность этого фермента зависит от концентрации прогестерона. При этом прогестерон может, как увеличивать образование проста-гландинов (Hermenegildo et al., 2005; Bridges et al., 2006), так и снижать его (Thorburn ret al., 1973; Gleeson et al., 1974; Hellberg et al., 1996; Hedin, Eriksson, 1997; Diaz et al., 2002).
В опытах по индукции созревания ооцитов осетровых рыб обычно используют прогестерон в концентрации 1 мкг/мл. Наши предварительные опыты показали, что она, по крайней мере, на порядок превышает максимально эффективную, а приведенные выше литературные данные свидетельствовали о том, что такая высокая концентрация может через подавление образования проста-гландинов отрицательно сказываться на индукции овуляции. Таким образом, в этой работе мы исследовали влияние двух факторов, которые могут влиять на гормональную индукцию овуляции ооцитов осетровых рыб in vitro — концентрации бикарбоната натрия и концентрации прогестерона. Для того чтобы судить о том, насколько стимулированные in vitro процессы созревания и овуляции проходят нормально, мы в большинстве опытов осеменяли зрелые яйцеклетки и следили за ходом их развития. Из-за отсутствия спермы осеменение не проводили только в опытах, сведенных в табл. 2.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Работа проводилась в апреле-мае. Основным объектом служили фолликулы стерляди (Acipenser ruthenus L.). Один опыт был поставлен также на фолликулах гибрида русского (Acipenser gueldens-taedtii Brandt) и сибирского (Acipenser baerii Brandt) осетра. Самки стерляди и гибрида были выращены на Краснодарском (Адыгейском) осетровом рыбоводном заводе. Фолликулы получали от самок стерляди и гибрида, находившихся в этот момент в бассейнах с температурой воды 10°С.
Овариальные фолликулы извлекали из тела самки с помощью специального металлического щупа и помещали в 75% среду L-15 (~15°). Их многократно отмывали этой же средой и хранили в ней при 4°С до опыта от 3—4 ч до суток. Перед распределением по чашкам Петри фолликулы промывали средами, соответствующими тем, в которых их в дальнейшем инкубировали. В среды добавляли пенициллин (500 ед./л) и стрептомицин (0.25 г/л).
В качестве индукторов созревания и овуляции ооцитов использовали прогестерон или препарат гонадотропного гормона гипофиза севрюги (сГТГ), очищенный по модифицированной описанной ранее методике (Burzawa-Gerard et al., 1975). Прогестерон вносили в чашки Петри в виде концентрированного спиртового раствора. Конечная концентрация гормона в среде культивирования была от 16 до 1000 нг/мл, а концентрация спирта 0.05%. сГТГ вносили в виде концентрированного раствора, приготовленного на РМО с 0.5 г/л бикарбоната натрия. Конечная концентрация сГТГ составляла 2 мкг/мл.
Фолликулы инкубировали в 5 мл или 7.5 мл среды в вентилируемых пластиковых чашках Петри диаметром, соответственно, 35 и 55 мм. В чашки помещали, соответственно, по 20—22 или 30—33 фолликула. Инкубацию фолликулов проводили в термостате при температуре 16 ± 0.2°C. Овуляцию учитывали путем подсчета отделившихся от ооцита оболочек фолликула.
Осеменение проводили по общепринятой в осетроводстве методике полусухим способом (см. Dettlaff et al., 1993). Перед осеменением РМО сливали и добавляли воду и сперму одновременно из расчета 1 : 25. Сперму предварительно проверяли на подвижность.
Для определения достоверности различий в проценте овулировавших ооцитов использовали критерий х2 для качественных показателей.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Влияние состава среды культивирования на индуцированную гормонами in vitro овуляцию ооцитов стерляди
В табл. 1 представлены результаты опытов по инкубации фолликулов восьми самок стерляди в двух разных средах (РМО, содержащем 0.5 и 2 г/л бикарбоната натрия) в присутствии двух гормональных препаратов (прогестерона и сГТГ). В этом опыте эффективность гормонов в использованных концентрациях в обеих средах была приблизительно одинакова. Видно, что и прогестерон, и сГТГ в среде с уменьшенной концентрацией бикарбоната натрия вызывают овуляцию в большем проценте случаев у всех самок. Влияние концентрации бикарбоната натрия несколько больше сказывалось при использовании прогестерона. Кроме того, было отмечено, что при снижении концентрации бикарбоната натрия не только увеличивается процент овулировавших ооцитов, но и процесс овуляция начинается раньше. Звездочками отмечен уровень значимости различий.
Влияние концентрации прогестерона на овуляцию in vitro ооцитов стерляди
В опытах были использованы три концентрации. Наименьшая (16 нг/мл) составляла примерно половину от той, которую мы использовали в описанных выше опытах, средняя (128 нг/мл) была больше ее примерно в четыре раза, а наибольшая (1 мкг/мл) равнялась той, которая ранее использовалась нами для индукции созревания и овуляции ооцитов. В качестве среды инкубации в этом опыте мы использовали РМО с 0.5 г/л бикарбоната натрия.
Опыты были проведены на фолликулах четырех самок стерляди. Результаты опытов представлены в табл. 2.
Можно видеть, что процент овулировавших ооцитов снижается при увеличении концентрации про
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.