научная статья по теме СТИМУЛЯЦИЯ MGAДФ-ИНАКТИВИРОВАННОЙ F1-ATФАЗЫ ХЛОРОПЛАСТОВ ВЫЗЫВАЕТСЯ СВЯЗЫВАНИЕМ ОКСИАНИОНОВ С НЕКАТАЛИТИЧЕСКИМИ ЦЕНТРАМИ Математика

Текст научной статьи на тему «СТИМУЛЯЦИЯ MGAДФ-ИНАКТИВИРОВАННОЙ F1-ATФАЗЫ ХЛОРОПЛАСТОВ ВЫЗЫВАЕТСЯ СВЯЗЫВАНИЕМ ОКСИАНИОНОВ С НЕКАТАЛИТИЧЕСКИМИ ЦЕНТРАМИ»

ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2013, том 450, № 1, с. 109-111

БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ

УДК 577.355.2

СТИМУЛЯЦИЯ М^АДФ-ИНАКТИВИРОВАННОИ РгАТФазы ХЛОРОПЛАСТОВ ВЫЗЫВАЕТСЯ СВЯЗЫВАНИЕМ ОКСИАНИОНОВ С НЕКАТАЛИТИЧЕСКИМИ ЦЕНТРАМИ © 2013 г. А. Н. Мальян

Представлено академиком В.А. Шуваловым 09.08.2012 г. Поступило 09.08.2012 г.

БОТ: 10.7868/80869565213130264

Сопрягающий фактор СБ1 является водорастворимой частью АТФ-синтазы хлоропластов и выполняет каталитическую функцию в процессах синтеза/гидролиза АТФ. Подобно другим АТФа-зам Бгтипа он состоит из чередующихся За- и Зр-субъединиц, окружающих двойную а-спираль у-субъединицы, а также 8- и б-субъединицы. На границах раздела а- и Р-субъединиц расположены 3 каталитических и 3 "некаталитических" нуклеотидсвязывающих центра [1, 2]. Последовательное участие каталитических центров в связывании АТФ, его превращении и диссоциации АДФ и фосфата сопряжено с вращением у-субъединицы [3]. Название "некаталитических" центров обусловлено низкой скоростью обмена нуклеотидов, связанных на этих центрах, с реакционной средой. Общим свойством Б1-АТФаз различного биологического происхождения является способность к М§- и АДФ-зависимой обратимой инактивации, вызываемой прочным связыванием АДФ с одним из каталитических центров [4]. Ряд физиологически важных соединений, включая анионы карбо-новых кислот и другие оксианионы (карбонат, фосфат, сульфит, борат, арсенит) [5], реактивируют Б1-АТФазы, вызывая диссоциацию АДФ [6]. Несмотря на значительный объем исследований, посвященных механизму действия оксианионов (см. работы [5—7] и приводимые в них ссылки), до настоящего времени дискутируется вопрос о природе центров, с которыми они связываются [8, 9]. В пользу связывания с каталитическими центрами говорит конкурентное ингибирование фотофос-форилирования сульфитом [7], в пользу связывания с некаталитическими центрами — подавление сульфитом и некоторыми другими оксианионами включения нуклеотидов в эти центры [8]. Для выяснения этого вопроса в настоящей работе иссле-

Институт фундаментальных проблем биологии Российской Академии наук, Пущино Московской обл.

довали влияние предварительной инкубации CF1 c пирофосфатом (PP¡) на стимуляцию М§АДФ-инактивированной CFrАТФазы оксианионами сульфита и бикарбоната. Выбор PP¡ определялся следующими соображениями. Подобно другим оксианионам, PPi обладает стимулирующим действием, но значительно более слабо выраженным, чем сульфит или бикарбонат. С другой стороны, PP¡ прочно и с высокой избирательностью связывается с некаталитическими центрами F1-АТФаз [10, 11]. При справедливости предположения о связывании оксианионов с некаталитическими центрами можно ожидать, что преинкубация фермента с PPi будет снижать их стимулирующее действие. В проведенном исследовании впервые показано, что преинкубация CF1 c PP¡ подавляет начальную стадию стимуляции АТФазной активности сульфитом и бикарбонатом. При продолжительной инкубации такого фермента в среде, не содержащей PP¡, стимулирующее действие ок-сианионов восстанавливается, при этом степень восстановления коррелирует с диссоциацией комплекса CF1 с PP¡. Полученные данные позволяют сделать однозначный вывод о том, что стимуляция АТФазной активности CF1 оксианиона-ми определяется их связыванием с некаталитическими центрами фермента. С учетом этих данных предложена схема инактивации/активации CF1-АТФазы с участием некаталитических центров.

Выделение CF1 из хлоропластов шпината и демаскирование его активности дитиотреитолом (ДТТ) проводили, как описано ранее [8]. Для получения М§АДФ-инактивированной формы CF1 освобождали от избытка нуклеотидов и сульфата аммония гель-фильтрацией через колонку сверхтонкого сефадекса G-50, уравновешенную 20 мМ Tris-HCl pH 7.8, 4 мМ MgCl2 и 50 мМ KCl (ТМК-буфер). Контрольный препарат CF1 готовили аналогичным образом, исключая из элюирующего раствора MgCl2. Для получения комплекса CF1 с

110

МАЛЬЯН

P, мкмоль/мг CF1

Время, мин

Рис. 1. Гидролиз АТФ MgАДФ-инактивированным СБ} до (1) и после (2) его инкубации в течение 5 мин с 0.5 мМ РР^ в ТМК-буфере и последующего освобождения от избытка РР^ гель-фильтрацией на колонке сефадекса 0-50. СБ^ преинкубированный в течение 1 ч в ТМК-буфере в присутствии 50 мМ ДТТ, вводили в реакционную среду. В указанные промежутки времени отбирали аликвоты объемом 0.5 мл и определяли содержание неорганического фосфата.

Рис. 2. Влияние преинкубации MgАДФ-инактивиро-ванного СБ1 с РР^ на гидролиз АТФ в отсутствие ок-сианионов и в присутствии Na2SOз или №НСОз. MgAДФ-инактивированный СБ} до (2, 4) или после (3, 5) его преинкубации с 0.5 мМ РР^ вносили в реакционную среду, содержащую 2 мМ АТФ, ТМК-буфер (1) и 50 мМ (2, 3) или 70 мМ №НСО3 (4, 5).

PPi за 5 мин до конца инкубации с ДТТ в среду вводили 0.5 мМ PPie После освобождения от избытка PPj ускоренной гель-фильтрацией фермент вводили в реакционную среду объемом 4 мл, содержащую 2 мМ АТФ, ТМК-буфер и, в зависимости от ожидаемой глубины превращения АТФ, 80—130 мкг CF1. Реакцию проводили при 22°С и контролировали по выделению неорганического фосфата [12]. Диссоциацию комплекса CF1 с PPi определяли по включению [3Н]АДФ в некаталитические центры фермента. Реакцию проводили в среде объемом 0.1 мл, содержащей, помимо изотопа, CFb преинкубированный с PPi, и ТМК-буфер. Остановку процесса включения радиоактивных нуклеотидов и их избирательное удаление с каталитических центров осуществляли по методике "cold chase" [13]. Обработку экспериментальных данных проводили с помощью программы Origin 6.0.

Для выяснения влияния связывания PPi с некаталитическими центрами исследовали действие преинкубации CFt c PPi на кинетику гидролиза АТФ. Использование преинкубированного фермента исключало вероятность ингибирующе-го действия PPi при включении его в реакционную среду. Как следует из рис. 1, прочное связывание PPi c некаталитическими центрами фермента ликвидирует лаг-фазу возрастания его активности, слабо влияя на стационарную актив-

ность. На рис. 2 показано, что преинкубация с РР^ сильно замедляет активацию фермента оксиани-онами. Судя по наклонам кривых, активности контрольного и преинкубированного фермента

Включение [3Н] АДФ, моль/моль CFt 2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

10

20

30

40 50 Время, мин

Рис. 3. Влияние преинкубации с РР^ на включение [3Н]АДФ в некаталитические центры MgАДФ-инак-тивированного СБ^ Контрольный (1) или преинкубированный с РР^ (2) СБ1 (1.0—1.5 мг/мл) инкубировали указанное время с 28 мкМ [3Н]АДФ в среде, содержащей ТКМ-буфер.

0

СТИМУЛЯЦИЯ МБАДФ-ИНАКТИВИРОВАННОЙ

111

Активная форма Неактивная форма Активная форма

АТФ АДФ Ox

НЦ КЦ АТФ АДФ АТФ АТФ АДФ АДФ АТФ АДФ АДФ • Ox

АТФ АДФ • P АТФ АДФш АТФ АДФ • P

Pi

АТФ АДФ

Рис. 4. Схема инактивации/активации СБ^АТФазы хлоропластов. НЦ и КЦ — некаталитические и каталитические центры соответственно; АДФ1Ь — прочно связанный АДФ, Ох — оксианион.

становятся равными через 20—25 мин инкубации, а полумаксимум активации достигается за 10— 15 мин. Данные рисунков согласуются с предположением, что взаимодействию оксианионов с некаталитическими центрами препятствует прочно связанный РР;. При справедливости такого предположения последующее возрастание активности может быть обусловлено медленной диссоциацией РР^ Литературные данные о скорости диссоциации РР; с некаталитических центров СБ1 отсутствуют. Поскольку связывание нуклеоти-дов и РР; исключают друг друга, оценку диссоциации РР; проводили по включению в некаталитические центры [3Н]АДФ. В случае контрольного СБ1 95%-е включение достигалось менее чем за 2 мин (рис. 3). Как показывают расчеты, включение [3Н]АДФ в фермент, преинкубированный с РР;, отвечает реакции первого порядка и характеризуется константой скорости к = 0.049 ± 0.007 мин-1 (?1/2 = 14 мин), что хорошо согласуется с кинетикой возрастания его активности в присутствии оксианионов (рис. 2) и предположением, что активирующее действие оксианионов определяется их связыванием с некаталитическими центрами.

Ранее было показано, что оксианионы инги-бируют включение АДФ и АТФ в некаталитические центры, причем характер ингибирования различен: в первом случае ингибирование имеет конкурентный характер, во втором — частично неконкурентный [8]. В связи с этим представляется весьма вероятным, что оксианионы взаимодействуют с некаталитическим центром по участку связывания у-фосфата, который в присутствии АДФ на этом центре остается вакантным. Принимая во внимание результаты настоящего исследования и литературные данные по инактивации/активации Б1-АТФаз, можно представить следующую схему обратимой инактивации СБ1-АТФазы (рис. 4). Схема согласуется с ранее принятыми представлениями о механизме инактивации/активации в том, что ее условием является прочное связывание/диссоциация АДФ на одном из каталитических центров. А ее основное отличие заключается в том, что прочность связи АДФ модулируется нуклеотидом [6, 14] и/или оксианио-

ном, которые включаются в некаталитическии центр. Схема учитывает неоднородность некаталитических центров [14]. Активной форме фермента соответствует состояние с АТФ, связанным на том центре, который способен включать как АТФ, так и АДФ. Замена АТФ на АДФ вызывает увеличение сродства АДФ к каталитическому центру и его прочное связывание, которое в свою очередь приводит к инактивации фермента. Реактивация СРгАТФазы возможна в условиях избытка АТФ в результате обмена АДФ на АТФ на некаталитических центрах либо в результате связывания ок-сианиона на том же некаталитическом центре, что и АДФ по участку связывания у-фосфата.

Автор выражает благодарность А.В. Крупянко за помощь в экспериментах.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Bowler M.W., Montgomery M.G., Leslie A.G.W., Walker J. // J. Biol. Chem. 2007. V. 282. P. 1423814242.

2. GiraudM.F. // J. Struct. Biol. 2012. V. 177. P. 490-497.

3. Sekiya M. // J. Biol. Chem. 2010. V. 285. P. 4205842067.

4. Smith L.T., Rosen G., Boyer P.D. // J. Biol. Chem. 1983. V. 258. P. 10887-10894.

5. Мальян А.Н., Акулова Е.А. // Биохимия. 1978. Т. 43. С. 1206-1211.

6. Matsui Т., Mu

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком