ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 4, с. 621-625
= МЕТОДИКА
УДК 581.1
СТИМУЛЯЦИЯ РЕГЕНЕРАЦИИ РАСТЕНИЙ В КУЛЬТУРЕ ТКАНЕЙ КУКУРУЗЫ ПОД ДЕЙСТВИЕМ АНТИБИОТИКА ЦЕФОТАКСИМА
© 2004 г. С. А. Данилова, Ю. И. Долгих
Институт физиологии растений им К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 14.05.2003 г.
Для определения влияния антибиотика цефотаксима на рост каллуса и морфогенез эмбриогенного каллуса кукурузы (Zea mays L.) линий А188 и R91 и гибрида F1 между ними инкубировали на среде с антибиотиком в концентрациях 50-500 мг/л в течение нескольких пассажей. Цефотаксим не оказывал влияния на частоту индукции и активность роста эмбриогенного каллуса, но активно стимулировал морфогенез. У обеих использованных линий и гибрида наибольшее увеличение количества регенерированных растений было отмечено при концентрации антибиотика 150 мг/л. Степень стимуляции морфогенеза и пределы усиливающих регенерацию растений доз цефотаксима зависели от особенностей каллусных тканей использованных генотипов.
Zea mays - цефотаксим - эмбриогенный каллус - регенерация
Традиционно для индукции морфогенеза in vitro используются фитогормоны и гормоноподоб-ные синтетические регуляторы роста. Однако для ряда генотипов эффективными в отношении регенерации растений оказываются нетрадиционные индукторы морфогенеза, такие, как олиго-сахарины, отдельные аминокислоты [1], интенсивность и качество света [2], слабый электрический ток [3] и др. Так, ксилоглюкановый пентасахарид стимулировал морфогенез в культуре тканей пшеницы [4], а трехчленный олигосахарид способствовал соматическому эмбриогенезу у хлопчатника [5]. Значительное увеличение количества регенерированных из каллуса кукурузы побегов было достигнуто благодаря применению препарата эмистима, который представляет собой экстракт ризофлоры женьшеня [6].
Для некоторых антибиотиков, в частности, цефотаксима, также показано положительное влияние на рост культивируемых тканей и морфогенез. Цефотаксим является полусинтетическим аналогом цефалоспорина, - антибиотика третьего поколения. Цефалоспорины выделяются грибами рода Cephalosporum, основной продуцент этого антибиотика, - гриб вида C. acremonium. По химическому строению антибиотик принадлежит к группе Р-лактамных соединений, близких к пени-
Адрес для корреспонденции: Данилова Светлана Алексеевна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений РАН. Факс: 07 (095) 977-80-18; электронная почта: svdan@yandex.ru
циллинам [7, с. 358-363]. Цефалоспориновые антибиотики эффективны в относительно низких дозах, имеют широкий спектр биологической активности, низкую токсичность для эукариот. Два из них, - карбенициллин и цефотаксим, широко применяются для элиминации Agrobacterium tume-faciens в опытах по генетической трансформации [8]. Влияние этих двух антибиотиков на рост каллуса и морфогенез уже отмечено у некоторых видов растений. Например, у яблони цефотаксим в концентрации 200 мг/л улучшал регенерацию и развитие побегов из апикальных почек, в концентрации 500 мг/л вызывал уродства у образующихся побегов, а карбенициллин в дозе 500 мг/л инги-бировал побегообразование и стимулировал рост каллуса [9]. У хлопчатника цефотаксим в зависимости от сорта или стимулировал, или ингибиро-вал развитие побегов из изолированных зародышевых осей [10]. У табака цефотаксим слабо ин-гибировал образование побегов из семядольных эксплантов и укоренение растений-регенерантов, полученных из листовых дисков [11]. Если реакция тканей двудольных растений на цефалоспориновые антибиотики была неоднозначной, то у злаковых растений описано только стимулирующее действие цефотаксима и карбенициллина. Mothias и Boyd [12] и Mothias и Mukasa [13] отмечали стимуляцию роста каллуса и усиление органогенеза в культурах ячменя и мягкой пшеницы. Barelli с соавт. [14] наблюдали повышение частоты образования эмбриогенного каллуса и регенерации растений у твердой пшеницы, причем, у низкоморфогенного сорта число регенерированных растений увеличивалось под действием анти-
Таблица 1. Влияние цефотаксима на частоту индукции эмбриогенного каллуса
Концентрация цефотаксима, мг/л Доля зародышей, образующих эмбриогенный каллус, %
А188 R91
0 52.6 ± 4.7 82.5 ± 7.1
100 48.3 ± 3.3 76.8 ± 6.4
150 54.5 ± 4.2 80.3 ± 7.8
250 56.2 ± 5.1 79.6 ± 5.9
500 51.4 ± 4.9 84.2 ± 8.1
Таблица 2. Влияние цефотаксима на интенсивность регенерации растений
Концентрация цефотак-сима, мг/л Среднее число побегов, полученных от одного каллуса
А188 R91 A188 х R91
0 1.2 ± 0.3 0.3 ± 0.1 1.3 ± 0.2
50 1.2 ± 0.2 0.5 ± 0.1 1.3 ± 0.3
100 1.5 ± 0.3 2.5 ± 0.3 1.6 ± 0.4
150 2.4 ± 0.2 5.4 ± 0.5 3.4 ± 0.3
250 1.3 ± 0.3 3.5 ± 0.4 2.3 ± 0.3
500 0.8 ± 0.4 2.9 ± 0.5 2.1 ± 0.3
опыления. Зерновки перед вычленением зародышей поверхностно стерилизовали коммерческим отбеливателем "Белизна" (стерилизующий агент -гипохлорид натрия, 7-9% активного хлора) и трижды промывали стерильной дистиллированной водой. Для индукции и культивирования каллуса использовали среду МигазЫ§е-8коо§ [17] с 1 мг/л 2.4-Д. Через каждые 20 сут каллус переносили на свежую среду. Формирующиеся побеги пересаживали на среду МС без гормонов. Культивируемые ткани и растения-регенеранты выращивали при температуре 26 ± 1°С, влажности 70%, освещенности 2-3 клк, при длине светового дня 16 ч.
Цефотаксим растворяли в стерильной воде и добавляли в проавтоклавированную и охлажденную до 45°С питательную среду непосредственно перед высадкой каллусов. Концентрацию антибиотика в среде варьировали от 50 до 500 мг/л. В качестве контроля использовали среды без цефотаксима. Влияние цефотаксима оценивали на стадиях индукции и роста каллуса и регенерации растений.
В каждом варианте опыта анализировали не менее 50 инокулюмов. В таблицах приведены средние значения из трех опытов со стандартной ошибкой.
биотика в 17 раз. Аналогичные результаты были получены и при применении антибиотика в культуре тканей сорго [15]. Влияние цефотаксима на культивируемые in vitro клетки кукурузы ранее не изучалось.
Задачей данной работы было исследование действия цефотаксима на индукцию и рост каллуса, а также на процесс морфогенеза в культуре тканей кукурузы.
МЕТОДИКА
В работе использовали две линии кукурузы (Zea mays L.) А188 и R91 и их гибрид F1 А188 х R91. Линия R91 была получена после пяти циклов самоопыления растений, регенерированных из кал-лусных тканей гибрида F1 Chinese 31 х Cateto Suli-no Grosso [16]. Семена инбредной линии А188 и гибрида Chi 31 х Cateto S.G. были любезно предоставлены сотрудником Краснодарского НИИ сельского хозяйства В.С. Щербаком. Растения выращивали в теплице, в сосудах с почвой объемом 5 л при температуре 20 ± 3°С в условиях 16-часового светового дня. Опыление проводили в контролируемых условиях с изоляцией мужских и женских соцветий.
Каллус получали из незрелых зародышей длиной 1-2 мм, выделенных на 10-12-е сутки после
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При культивировании незрелых зародышей кукурузы на среде для индукции каллуса одновременно с каллусообразованием обычно происходит прорастание большинства зародышей. Введенный на этой стадии в среду антибиотик не оказывал существенного влияния на долю незрелых зародышей, образующих эмбриогенный каллус (табл. 1), а также на интенсивность каллусообра-зования. Вместе с тем, цефотаксим заметно ускорял развитие проростков: длина корней и побегов независимо от концентрации антибиотика увеличивалась в 3-5 раз.
Для определения влияния цефотаксима на рост каллуса и морфогенез эмбриогенные ткани культивировали на среде с антибиотиком в течение шести пассажей. Не было отмечено положительного влияния цефотаксима на рост каллуса: масса инокулюмов увеличивалась в среднем в 5 раз как на среде с антибиотиком, так и в контроле. Зато присутствие в среде цефотаксима в определенных концентрациях значительно увеличивало количество регенерируемых растений (табл. 2). У обеих использованных линий и гибрида А188 х х Я91 наибольшая стимуляция была отмечена при концентрации антибиотика 150 мг/л. У линии А188 цефотаксим усиливал морфогенез только в концентрации 150 мг/л, у гибрида А188 х Я91 частота регенерации повышалась под действием ан-
Рис. 1. Влияние цефотаксима на развитие эмбриогенного каллуса кукурузы линии R91. 1 - среда с цефотаксимом (150 мг/л); 2 - контроль (среда без цефотаксима).
тибиотика в дозах от 150 до 500 мг/л, а у линии R91 - от 100 до 500 мг/л. Степень повышения частоты регенерации зависела от генотипа. Так, у линии А188 число регенерированных побегов на каллус возросло в 3 раза, у гибрида А188 х R91 -в 2.6 раза, а у линии R91 - в 18 раз (рис. 1).
Цефотаксим ускорял дифференцировку эмбриогенного каллуса кукурузы. Стимулирующее действие антибиотика на регенерацию растений начинало проявляться со второго пассажа. Количество регенерированных побегов достигало максимума в пятом пассаже, а затем резко уменьшалось. Если без применения цефотаксима регенерация растений из эмбриогенного каллуса продолжалась до двух лет, то в присутствии антибиотика полная дифференциация каллуса происходила за 6-7 пассажей (рис. 2).
Причины активации роста и морфогенеза под действием антибиотиков еще не выяснены. В литературе обсуждаются, главным образом, две гипотезы: либо освобождение культивируемых тканей от скрытой контаминации микроорганизмами, либо влияние биологически-активных веществ, образующихся при распаде используемых реагентов. Первая версия представляется сомнительной, так как многие другие антибиотики сильно угнетают рост клеток и процессы регенерации растений in vitro [18]. В наших опытах канамицин полностью ингибировал морфогенез в каллусной ткани кукурузы уже при концентрации 25 мг/л (неопубликованные данные).
Показано, что одним из продуктов разложения карбенициллина является фенилуксусная кислота, обладающая ауксиновой активностью [19]. Возможно, биологическая активность цефотаксима, относящегося к той же группе цефалоспо-риновых антибиотиков, также связана с образованием при его разложении стимуляторов роста и морфогенеза.
Характер стимуляции морфогенеза под действием антиби
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.