БИОИНФОРМАТИКА
УДК 577.21
СТРАТЕГИЯ ПОДБОРА ЗОНДОВ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ СОВОКУПНОСТИ мРНК УЧАСТНИКОВ РЕЦЕПТОР-ОПОСРЕДОВАННОГО СИГНАЛИНГА АПОПТОЗА
© 2015 г. Л. А. Солнцев1*, В. Д. Старикова1, Н. А. Сахарнов1, Д. И. Князев1, О. В. Уткин12
Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной, Нижний Новгород, 603950
2Нижегородская государственная медицинская академия, Нижний Новгород, 603005
Поступила в редакцию 20.08.2014 г.
Принята к печати 20.10.2014 г.
Рецепторы смерти и участников опосредованного ими сигналинга можно охарактеризовать наличием большого числа изоформ мРНК, образующихся в результате альтернативного сплайсинга. При этом традиционные методы (ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в реальном времени) малоэффективны для параллельного выявления множества изоформ мРНК в силу высокой трудоемкости и значительных финансовых затрат. В связи с этим перспективно использование ДНК-биочипов, позволяющих анализировать экспрессию большого числа генов одновременно. В работе подобрана оптимальная стратегия поиска зондов для раздельной детекции максимально возможного числа сплайсированных вариантов мРНК основных участников сигналинга, опосредованного рецепторами смерти. В качестве объектов исследования определены 185 генов, формирующих суммарно 1134 изоформы мРНК. В результате создан дизайн биочипа, позволяющего определять 499 изоформ мРНК (44% от общего числа сплайсированных вариантов мРНК). Предлагаемая стратегия сочетает в себе высокую степень модульности, возможность использования современных высокопроизводительных компьютеров и широкие возможности по заданию критериев отбора в соответствии с задачами исследования.
Ключевые слова: ДНК-биочип, альтернативный сплайсинг, апоптоз, рецепторы смерти, мРНК, алгоритм Ахо-Корасик, Ге1сИС^'1.
STRATEGY OF PROBES SELECTION FOR STUDYING mRNAs, PARTICIPATING IN RECEPTOR-MEDIATED APOPTOSIS SIGNALING, by L. A. Solntsev1*, V. D. Starikova1, N. A. Sakharnov1, D. I. Knyazev1, O. V. Utkin1'2 (1Blokhina Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology of Nizhny Novgorod, Nizhny Novgorod, 603950 Russia;*e-mail: solntsev.l.a@nniiem.ru; ^Nizhny Novgorod State Medical Academy, Nizhni Novgorod, 603005 Russia) Death receptors (DRs) and the participants of DR-mediated signaling are characterized by having a large number of mRNA isoforms generated by alternative splicing. Due to the high labor intensity and high cost, conventional methods (RT-PCR and RT-PCR in real time) are ineffective for the case, when simultaneously detection of a plurality of mRNA isoforms is needed. In this regard, the use of DNA biochips.is perspective, allowing to analyze the expression of many genes simultaneously. In this paper, we suggest an optimal strategy of probes selection, aimed to detect maximum number of mRNA splice variants, that are generated by major participants of DRs-signaling. The objects of the study were 185 genes, which form 1134 mRNA isoforms. As a result the biochip design permitting detection of 499 mRNA isoforms (44% of total mRNA splice variants) was developed. The proposed strategy combines a high degree of modularity, the use of modern high-performance computers and wide opportunities for setting up selection criteria in accordance with the objectives of the study.
Keywords: DNA-microarray, splicing, apoptosis, death receptors, mRNA, algorithm Aho-Corasick, fetchGWI. DOI: 10.7868/S0026898415030167
Принятые сокращения: РС — рецепторы смерти; ФНО — фактор некроза опухоли; DD — домен смерти.
* Эл. почта: solntsev.l.a@nniiem.ru
515 10*
ВВЕДЕНИЕ. ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ
Представители суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли (ФНО) рецепторы смерти (РС) содержат цитоплазматический домен смерти (DD). К настоящему времени у млекопитающих обнаружено 8 DD-содержащих рецепторов: TNFR1, FAS, DR3, DR4, DR5, DR6, EDAR и p75NTR [1]. В зависимости от физиологической ситуации, типа клеток и участвующей системы рецептор-лиганд активация РС может привести к запуску апоптотических, провоспалитель-ных или пролиферативных сигнальных путей [2].
Существует множество изоформ мРНК РС и участников РС-опосредованного сигналинга, образующихся в результате альтернативного сплайсинга [3, 4]. Функции продуктов трансляции различных мРНК могут существенно отличаться. Например, растворимые варианты DR3 и FAS ин-гибируют апоптоз, инициированный с помощью мембранных форм данных рецепторов [5—7]. Таким образом, решение о судьбе клетки зависит от совокупности всех вариантов молекул, участвующих в инициации и трансдукции разнообразных сигналов [8]. Нарушения регуляции экспрессии сплайсированных вариантов основных участников РС-опосредованного сигналинга, а также этапов его реализации часто ассоциированы с развитием заболеваний инфекционного и неинфекционного генеза [9, 10], что обусловливает актуальность изучения данной проблемы. Кроме того, анализ флуктуации качественного и количественного состава сплайсированных вариантов мРНК РС и других сигнальных молекул потенциально перспективно для оценки функционального состояния клеточного звена иммунной системы, мониторинга тяжести течения заболеваний различной этиологии, а также адекватности и эффективности проводимой терапии.
В связи с трудоемкостью исследования всей совокупности альтернативных вариантов мРНК членов РС-опосредованных сигнальных путей классическими методами (ОТ-ПЦР, ОТ-ПЦР в реальном времени, нозерн-блот, секвенирование по Сэнгеру) перспективным оказывается применение метода биологических микрочипов высокой плотности [11, 12]. Использование таких биочипов позволяет анализировать экспрессию большого количества генов одновременно.
Одна из ключевых проблем технологии олиго-нуклеотидных микрочипов — конструирование зондов, обеспечивающих получение биологически достоверной информации [13]. На данный момент существуют три принципиальных подхода к созданию микрочипов для полуколичественнго выявления сплайсированных вариантов мРНК.
1. Подбор зондов, комплементарных местам соединения экзонов.
2. Выбор зондов, комплементарных последовательностям непосредственно экзонов. Данный подход реализован в коммерческом продукте Human Exon 1.0 ST Array (Affymetrix, США), наиболее часто использующемся при исследованиях альтернативного сплайсинга с помощью микрочипов.
3. Равномерное "покрытие" генома зондами одинаковой длины с фиксированным интервалом между зондами (tiling arrays). Данный подход позволяет дискриминировать нетранслируемые участки в составе зрелой мРНК.
Цель данного исследования — разработка оптимальной стратегии подбора зондов для раздельной детекции и полуколичественного анализа максимально возможного числа сплайсирован-ных вариантов мРНК основных участников сиг-налинга, опосредованного РС.
ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ И ОБОСНОВАНИЕ ПРЕДЛАГАЕМОГО ПОДХОДА
Проблема подбора зондов для включения их в состав биочипа на сегодняшний день весьма актуальна. При этом в подавляющем большинстве работ, посвященных данной тематике, вопросу выбора оптимального алгоритма отбора зондов часто уделяется мало внимания. Базовой может считаться работа [14], в которой авторы рассмотрели основные принципы селекции зондов для создания биочипов. Ключевые критерии отбора зондов — термодинамические параметры, степень уникальности (проверка с помощью BLAST) и вторичная структура [12, 15—18]. Также для селекции зондов используют информационную меру на основе индекса энтропии Шеннона [19]. Оригинальный подход к отбору уникальных зондов описан в работе [20]. Авторы предложили предварительно выделять участки генома, где обнаружено наибольшее разнообразие нуклеотидного состава и меньшее перекрытие с другими областями. Выделенные участки служат основой для дальнейшей селекции.
Существуют готовые программные продукты, предназначенные для подбора зондов. Примерами могут служить OligoArray [15], OligoWiz [18], ArrayOligoSelector [21], ProbeSel [22]. Мы полагаем, что недостаток таких программ состоит в скрытии процесса вычисления от исследователя. Также к серьезным минусам можно отнести отсутствие возможности внесения корректив в используемые авторами алгоритмы. Таким образом, подобные решения делают исследователя до известной степени "заложником" той логики, которую закладывали в проект авторы продуктов. Кроме того, программа OligoWiz — клиент-серверное приложение, которое не позволяет спрогнозировать время, необходимое для получения результатов вычислений. OligoArray не предназна-
пре-мРНК
Экзон 1 Экзон 2
мРНК
Экзон 1 Экзон 2
Зонд
Сходство зонда и пре-мРНК составляет 100%
мРНК
Экзон 1 Экзон 2
Зонд
Сходство зонда и пре-мРНК составляет 80%
мРНК
а
в
г
Рис. 1. Различные варианты гибридизации зонда и изоформ мРНК.
чен для работы со сплайсированными вариантами молекул, РгоЪе8е1 не детектирует возможность образования "шпилек", а АггауОИ§о8е1ее1ог используют только для поиска зондов длиной 70 п.н.
Мы сформировали и реализовали стратегию поиска зондов для анализа экспрессии сплайси-рованных изоформ мРНК, участников РС-опо-средованного сигналинга, лишенную вышеперечисленных недостатков. В основу взяли общепринятые критерии отбора зондов, рассмотренные в работах[14,17].
Формирование первичного набора зондов. В
первую очередь мы составили список первичных зондов (протозондов). С этой целью каждую из последовательностей изоформ мРНК генов, участвующих в РС-опосредованных сигнальных каскадах, разбивали на участки длиной от 24 до 40 п.н. Последовательности, комплементарные этим участкам мРНК, были протозондами. Такие относительно короткие зонды обладают повышенной специфичностью к целевым мРНК и обеспечивают лучшую дискриминацию между сплайсированными вариантами [15, 23]. Повторяющиеся фрагменты убирали из набора. В результате в списке оставляли все возможные про-тозонды длиной от 24 до 40 п.н. для каждой конкретной изоформы мРНК.
Проверка термодинамических свойств зондов.
Важный критерий способности зондов к гибридизации с матрицей при одинаковых условиях — однородность по термодинамическим характеристикам. Каждый зонд проверяли на со
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.