МИКРОБИОЛОГИЯ, 2007, том 76, № 6, с. 865-871
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^ СТАТЬИ
УДК 579.835.91.022
СТРАТЕГИЯ ВЫЖИВАНИЯ ЕВЕЬЬОУ1ЕШО
© 2007 г. Н. Ю. Маркелова
Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино Поступила в редакцию 11.07.2006 г.
Изучено влияние кадмия и диурона - поллютантов, являющихся типичными загрязнителями окружающей среды, на выживаемость бактерий-хищников рода БёеПоу1Ьгю. Показано, что процессы адгезии и когезии бделловибрионов увеличивают их устойчивость к повреждающему воздействию ксенобиотиков. Продемонстрирована более стойкая жизнеспособность БёеНоуАпо, находящегося в стадии бделлопласта. Представленные результаты подтверждают концепцию поверхностно-ассоциированного существования БёеПоуЛпо в природе и дают основание для рекомендации использования потенциала бактерий-хищников в решении проблем здоровья населения, биозащиты экоси-стемот микробного и биотеррористического загрязнения.
Ключевые слова: экология Bdellovibrio, стратегия выживания, устойчивость бделлопластов.
Степень антропогенной трансформации биосферы, по-видимому, перешла тот рубеж, когда можно было полагаться на процессы спонтанного самоочищения экосистем, поэтому в последнее время создаются новые биотехнологии, направленные на преодоление кризисных ситуаций, в большинстве своем ориентированные на деградацию чужеродных соединений. Вместе с тем, не меньшую, а возможно большую опасность представляют возрастающие масштабы микробного загрязнения. В настоящее время наиболее традиционно используемым методом для устранения повышенного микробного загрязнения является дезинфекция. Но не всегда и не везде можно применять этот метод. Кроме того, многие дезинфек-танты, например, наиболее распространенный для этих целей хлор, сами являются поллютанта-ми, вызывая тем самым вторичное загрязнение окружающей среды. Понимание того, что наиболее экологически безопасными путями решения проблемы могут быть технологии, основанные на реализации принципов, действующих в природе, привело к углубленному изучению последних. Известно, что процесс естественного самоочищения окружающей среды зависит от ряда физических и химических факторов, а также функциональной активности природных микробных популяций. Разумеется, микробные сообщества имеют свою специфику механизмов саморегуляции, но внушительную роль в контроле их численности занимают бактерии-хищники рода Bdellovibrio, которые рассматриваются как биологический фактор, ответственный за поддержание микробного равновесия и регуляцию плотности микроб-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: markelova@issp.ser-pukhov.su).
ных популяций в природе [1]. Патогенные бактерии, загрязняя воду, представляют опасность распространения инфекционных заболеваний, а хищные бактерии, как постоянные обитатели водоемов, могут размножаться в патогенах, уменьшая при этом их численность и снижая риск появления инфекции.
Чем замечательны эти бактерии, открытые около 40 лет назад [2]? Их особенностью является способность инфицировать и размножаться внутри других бактерий. До недавнего времени бделловибрионы рассматривались как обитатели водной фазы экосистем. В рамках этой концепции оказалось затруднительным объяснить факт их существования в водоемах, где концентрация потенциальных жертв намного ниже уровня, критического для размножения бделловибрионов. БёеПоуЛпо требуют для своего развития численности жертвы не меньше, чем 106 кл/мл. Известно, что такой концентрации бактерий в природе нет, однако БёеПоуЛпо там всегда присутствуют. Следовательно, требовалась иная концепция, иные методы решения проблемы. Еще в 1966 г. Шило констатировал [3], что в попытках получить ответ на вопрос о роли БёеПоуЛпо в природе, возможно, в качестве отправного момента используются не те предпосылки, изучается не та природная среда. Понадобилось много времени, прежде чем мы пришли к заключению, что Бёе1-!о-у1Ьпо являются скорее обитателями поверхностей, чем водной толщи. Ассоциация бделловибрионов с поверхностями рассматривалась как простое физическое прикрепление, а вопрос о возможности взаимодействия в таких условиях с бактериями-жертвами вообще не ставился. Более того, колонизация микроорганизмами поверхно-
стей рассматривалась как стратегия защиты именно от паразитов, каковыми и являются Bdell-ovibrio [4]. Однако поверхности обеспечивают главное для размножения популяции Bdellovibrio условие - необходимый уровень клеточной плотности потенциальных бактерий-жертв, на несколько порядков превышающий таковой в водной фазе. И именно это положение легло в основу предложенной нами концепции об иммобилизации клеток Bdellovibrio как стратегии их жизни в естественной среде обитания [5, 6]. Согласно нашей концепции, поверхности как структуры для поддержания самовосстанавливающихся источников поступления бделловибрионов в водную толщу, играют роль регуляторов численности бактерий-хищников в условиях, благоприятствующих их размножению. Концепция получила экспериментальное подтверждение в дальнейших наших работах, а также и в работах других исследователей.
Цель настоящей работы - провести оценку выживаемости свободноживущих и прикрепленных к поверхностям бактерий-хищников рода Bdellovibrio в сравнении с таковой свободноживущих бделловибрионов, в присутствии поллютан-тов - кадмия и диурона, являющихся реальными загрязнителями окружающей среды.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Работу проводили с культурой Bdellovibrio bacteriovorus 100 NCJB 9529, полученной от проф. Штольпа, Германия [7]. В качестве бактерии-хозяина использовали Pseudomonas fluore-scens ВКМ В-1471. Культивирование B. bacteriovorus и P. fluorescens и их взаимодействие проводили как было описано ранее [8, 9]. В качестве поллютантов использовали коммерческие препараты CdCl2 ("Sigma", Германия), диурон (3-(3,4-дихлорфенил)-1,1-диметилмочевина) ("Sigma", Германия). CdCl2 растворяли в дистиллированной воде и стерилизовали фильтрацией через фильтры "Nalgene, Co" (США) с диаметром пор 0.1 мкм. Диурон растворяли в ацетоне и затем также стерилизовали фильтрацией. Ацетонсодержа-щие контроли были включены в эксперимент. Изучение взаимодействия бделловибрионов с псевдомонадами в жидкой культуре в присутствии 10 мкг/мл диурона и 10 мкг/мл CdCl2 проводили при 25°С в течение 15 сут, анализируя через определенные интервалы времени количество клеток Bdellovibrio и их жертв, P. fluorescens, в 1 мл суспензии. Число клеток B. bacteriovorus и бделло-пластов определяли по количеству бляшкообразу-ющих единиц методом двухслойного агара [7], а количество клеток P. fluorescens - по числу колоний, выросших на триптон-соевом агаре (ТСА), "BBL MS, Becton Dickinson a. Co" (США) и выра-
жали в количестве колониеобразующих единиц (КОЕ).
Для изучения влияния поллютантов на поверхностно-растущие клетки двухкомпонентной бактериальной системы осуществляли иммобилизацию B. bacteriovorus и P. fluorescens на прозрачном пластиковом носителе диаметром 12 мм ("Fisher Scientific", США), как было описано ранее [8]. Поверхностно-ассоциированные двухкомпонентные культуры помещали в емкости с 3 мл дистиллированной воды, содержащие CdCl2 (10 и 50 мкг/мл) или диурон (10 и 50 мкг/мл) и выдерживали в течение 15 сут при комнатной температуре. Подсчет количества свободных и внутриклеточных клеток бделловибрионов и интактных клеток псевдомонад на поверхности пластикового носителя проводили ежедневно после их окрашивания акридиновым оранжевым, как было описано ранее [8].
Для исследования использовали световой микроскоп Axioscope-40 ("Carl Zeiss", Германия) и флуоресцентный микроскоп Bx60 ("Olympus Optical" Co LTD, Япония).
Эксперименты по оценке влияния поллютантов на выживаемость бделловибрионов проводили в четырех повторностях, в статье приведены их средние значения.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Исследование влияния поллютантов на жизнедеятельность Bdellovibrio поможет получить дополнительные знания о защитной роли поверхностей в экологии бделловибрионов. На рис. 1 схематично представлена последовательность этапов жизненного цикла Bdellovibrio при взаимодействии хищников с бактериями-жертвами. Взаимодействие начинается с прикрепления бделловибрио-на к клеточной стенке бактерии-жертвы, затем он проникает в периплазму, где и происходит его внутриклеточное развитие, завершающееся лизисом пораженной клетки и выходом многочисленного потомства. Следует обратить внимание, что инфицированная клетка при этом изменяет свою морфологию и из палочкообразной превращается в сферическую, называемую бделлопла-стом. Согласно предложенной нами схеме (рис. 2), внутриклеточные Bdellovibrio, находящиеся внутри бделлопластов, т.е. покрытые оболочкой уже мертвой клетки бактерии-жертвы, это не просто транзитная экологическая ниша, а наиболее функционально значимая стадия инфекционного цикла паразита. Ассоциируясь с поверхностями, бделлопласт либо интегрируется в уже сформировавшееся сообщество, либо синтезирует свой собственный полимерный матрикс, который может колонизироваться другими бактериями. Вновь сформированное потомство паразитов либо продолжает инфицировать клетки, включенные
Рис. 1. Стадии жизненного цикла БйеПоугЪгго: 1 - свободные бделловибрионы; 2 - прикрепление бделло-вибриона к бактерии-жертве; 3 - проникновение бделловибриона в клетку бактерии-жертвы, формирование бделлопласта; 4,5- развитие потомства бделловибрионов внутри клетки бактерии-жертвы (бделлопласта); 6 - деление клеток бделловибрионов; 7 - лизис клетки бактерии-жертвы и выход дочерних клеток бделловибрионов наружу.
в полимерный матрикс, либо мигрируют в водную толщу, где их судьба будет определяться наличием потенциальных жертв. Бделлопласт же может находиться в прикрепленном к поверхности состоянии до тех пор, пока концентрация жертв будет недостаточна для развития ШеПоу^Ъпо. Нами было показано, что при концентрации бактерий-жертв ниже 105 кл/мл, либо при других неблагоприятных условиях (температурный фактор, присутствие поллютантов и т.д.) происходит блокирование терминальных стадий инфекционного цикла, и паразит как бы оказывается запечатанным в бделло-пласте [6, 9, 10]. В да
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.