УДК 577.152.3
СТРЕПТОКИНАЗА И СТАФИЛОКИНАЗА: РАЗЛИЧИЯ КИНЕТИКИ И МЕХАНИЗМА ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С ПЛАЗМИНОГЕНОМ, ИНГИБИТОРАМИ И ФИБРИНОМ
© 2015 г. Р. Б. Айсина*, #, Л. И. Мухаметова*, Д. А. Гулин**, К. Б. Гершкович**, С. Д. Варфоломеев*
*ФГБОУМосковский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Химический факультет, 119992, Москва, Ленинские горы **ФГБУНИнститут биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, 119991, Москва Поступила в редакцию 19.12.2014 г. Принята к печати 08.04.2015 г.
Проведено сравнительное in viftü-исследование кинетики различных реакций, вовлекаемых в процесс тромболизиса, инициируемый стрептокиназой (SK) и рекомбинантной стафилокиназой (STA). При взаимодействии плазминогена (Pg) с SK или STA в эквимолярных соотношениях скорость образования и удельная эстеразная активность комплекса плазмина (Pm) c SK (Pm«SK) была выше, чем комплекса Pm'STA. При этом каталитическая эффективность (kcat /Km) гидролиза хромогенных субстратов плазмина комплексом Pm«SK была в 2 раза выше, чем комплексом Pm'STA. В отсутствие фибрина каталитическая эффективность (kPg/KPg) активации гликоформы II Glu-плазминогена и Lys-плазминогена комплексом Pm«SK была выше, чем комплексом Pm «STA. Однако присутствие фибрина повысило kPg/KPg активации обоих плазминогенов гликоформы II комплексом Pm'STA более значительно, чем комплексом Pm«SK благодаря снижению KPg. Показано, что, в отличие от STA (15.5 кДа), молекула SK (47 кДа) создает значительные стерические затруднения для взаимодействия плазмина в комплексе Pm«SK с белковыми ингибиторами. Кроме того, SK вызывала большую деградацию фибриногена в плазме, чем STA. Комплексы Pm«SK и Pm'STA лизировали фибриновые сгустки в буфере с близкими скоростями, в то время как скорости лизиса плазменных сгустков, погруженных в плазму, комплексом Pm'STA была значительно выше, чем комплексом Pm«SK. Обнаружено, что видовая специфичность STA и SK определяется, в основном, скоростью образования и эффективностью комплексов Pm«SK и Pm'STA в активации аутологического плазминогена. Эффективность лизиса плазменных сгустков млекопитающих падала в ряду: человек > собака > кролик для SK и собака > человек > кролик для STA. Полученные результаты показывают, что в чистой системе SK является более эффективным активатором плазминоге-на, чем STA. В системе, содержащей фибрин и a2AP, активаторная и фибринолитическая активности STA выше, чем SK, благодаря повышенной стабильности в плазме и фибрин-специфичности STA, быстрой реакции комплекса Pm« STA с a2AP и способности STA к рециклизации в присутствии a2AP.
Ключевые слова: стрептокиназа, стафилокиназа, активация плазминогена, ингибирование, стабильность, фибринолиз, фибриногенолиз.
DOI: 10.7868/S0132342315050036
ВВЕДЕНИЕ
Стрептокиназа (SK), секретируемая Streptococcus equisimilis, и рекомбинантная стафилокиназа
Сокращения: Pg — плазминоген, Glu-Pg и Lys-Pg — Glu-плаз-миноген и Lys-плазминоген, Glu-PgII и Lys-PgII — гликоформы II Glu-плазминогена и Lys-плазминогена, Pm — плазмин, SK — стрептокиназа, STA — стафилокиназа, Pg *SK, Pm*SK, Pg *STA и Pm*STA — эквимолярные комплексы плазминоген-стрептокиназа, плазмин—стрептокиназа, плазминоген—стафилокиназа и плазмин—стафилокиназа, LBS — лизинсвязыва-ющие центры, tPA — тканевый активатор плазминогена, uPA — двухцепочечная урокиназа, a2AP — а2-антиплазмин, SIT — соевый ингибитор трипсина, FM — растворимый фибрин-мономер, AFK-pNA — HCO-Ala-Phe-Lys-я-нитроанилид, Z-Lys-pNP — п-нитрофениловый эфир Лг-бензилоксикарбонил-Х-лизина, 6-AHA — 6-аминогексановая кислота.
#Автор для переписки (тел: +7 (495) 939-50-83, факс: + 7(495) 939-54-17, e-mail: aisina2004@mail.ru).
(STA), продуцируемая Staphylococcus aureus, используются в качестве тромболитических агентов. В терапии тромбозов SK начала применяться с 1950 годов, а рекомбинантная STA — лишь в последние годы. Молекула SK (47 кДа) представляет собой одноцепочечный белок, имеющий подвижную многодоменную структуру [1] и не содержащий углеводные и липидные компоненты [2]. Рекомбинантная STA (15.5 кДа) — одноцепочечный белок, состоящий из 136 а.о. и не содержащий дисульфидных связей [3, 4]. В отличие от прямых активаторов плазминогена урокиназного (uPA, урокиназа, КФ 3.4.21.31) и тканевого типа (tPA, КФ 3.4.21.68), бактериальные SK и STA не обладают ферментативной активностью и относятся к активаторам плазминогена непрямого действия, т.к. приобретают активаторную актив-
ность после образования эквимолярных комплексов с плазминогеном (Pg). Несмотря на это сходство, STA тромболитически более эффективна в лизисе фибриновых сгустков и вызывает меньшее разрушение фибриногена в плазме крови человека, чем SK [5]. Терапевтические свойства активаторов плазминогена обусловлены механизмами их действия.
Скорость активации плазминогена определяется конформацией и типом гликозилирования его молекулы, а также специфичностью его кринглов к определенным лигандам. Нативный Glu-плазминоген является одноцепочечным гли-копротеином (93 кДа, Glu-Pg), который содержит ^-терминальный пептид (NTP), пять гомологичных крингл-доменов (K1—К5) и протеазный домен [7]. Кринглы плазминогена содержат лизин-связывющие центры (LBS), играющие важную роль в его связывании с фибрином, а2-антиплаз-мином (a2AP) и различными рецепторами. В присутствии следовых концентраций плазмина (Pm, КФ 3.4.21.7) отщепляется NTP (остатки 1—77) и образуется Lys-плазминоген (85 кДа, Lys-Pg). Расщепление активационной связи Arg561-Val562 в молекуле плазминогена под действием его активаторов приводит к образованию двухцепочечной молекулы плазмина.
В зависимости от условий молекула Glu-Pg может принимать разные конформации: компактную "закрытую" a-конформацию, которая поддерживается двумя внутримолекулярными взаимодействиями (между LBS на крингле 5 и Л-терминальным пептидом, и между LBS на крингле 4 и лигандом на крингле 3), "полуоткрытую" ß-конформацию, когда одно из двух взаимодействий еще сохраняется, и полностью "открытую" у-конформацию при разрушении обоих внутримолекулярных взаимодействий [8]. Lys-Pg может иметь только ß- или у-кон-формацию и активируется быстрее, чем Glu-Pg [9]. В плазме крови плазминоген присутствует в виде двух гликоформ, имеющих одинаковую аминокислотную последовательность [10]. Гликоформа I содержит О- и ^-связанные углеводные цепи, а гли-коформа II — только О-связанную углеводную цепь. ^-Связанный олигосахарид расположен на крингле 3 (на Asn289), а О-связанный олигосахарид — между кринглами 3 и 4 (на Thr346). Гликоформа I активируется под действием uPA, tPA и STA медленнее, чем гликоформа II [11, 12].
SK и STA активируют плазминоген через образование с ним эквимолярного комплекса. Прочный комплекс Pg «SK (Kd = 0.05 нМ [13]) образуется за счет высокоаффинных взаимодействий SK с протеазным доменом плазминогена и С-терми-нального Lys414 SK с кринглом 4 плазминогена [14-16], а в комплексе Pg «STA (Kd = 10.75 нМ [17]) в три раза меньшая молекула STA связана только с протеазным доменом плазминогена [6]. За счет
быстрых конформационных изменений в молекуле плазминогена (к = 9-23 мс-1) под действием SK формируется активный центр без протеолиза с образованием активного комплекса Pg «SK [18, 19]. Конформационно активированный комплекс Pg «SK катализирует начальный цикл внутримолекулярного превращения плазминогена в плазмин, который действует как триггер [20], и комплекс Pg «SK быстро (к = 0.24 мин-1 [21]) превращается в комплекс Pm'SK. Как Pg'SK, так и Pm'SK способны активировать избыток свободного плазминогена, в то время как комплекс Pg • STA неактивен в отношении плазминогена. Активация плазминогена стафилокиназой инициируется следовыми количествами плазмина, при этом образуется активный комплекс Pm'STA, который активирует свободный плазминоген, а также ускоряет медленную реакцию (к1 = 4 х 10-7 с-1 [3]) превращения Pg «STA в Pm'STA [6, 22]. Ранее разными группами ученых, специализирующимися на исследовании либо SK, либо STA, было опубликовано большое число статей, описывающих отдельные свойства индивидуальных активаторов. Имеется ограниченное число публикаций, посвященных сравнению взаимодействия SK и STA с плазминоге-ном, их тромболитических и иммунологических свойств и видовой специфичности [3, 5, 23, 24].
В данной работе представлены полученные нами результаты комплексного сравнительного кинетического исследования свойств SK и STA in vitro, включая образование активаторных комплексов Pm'SK и Pm'STA, их взаимодействие с плазминогеном человека и белковыми ингибиторами, стабильность в буфере и плазме человека, лизис фибриновых и плазменных сгустков и фиб-риногенолиз под действием двух активаторов, а также различия во взаимодействии SK и STA с плазминогенами разных видов млекопитающих. На основании сравнительного анализа различных свойств SK и STA будут продемонстрированы структурные и функциональные основы различия терапевтических свойств двух бактериальных активаторов плазминогена.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Процесс растворения фибрина сгустка под действием uPA и tPA инициируется прямым расщеплением ими активационной связи Arg561-Val562 в молекуле плазминогена человека. Образовавшийся фермент плазмин затем растворяет свой физиологический субстрат - фибрин. В случае бактериальных SK и STA процесс фибринолиза инициируется связыванием их с плазминогеном с образованием каталитических количеств эквимолярных комплексов Pg'SK(Pm'SK) и Pm'STA, которые активируют избыток свободного плазминогена в плазмин. Для сравнения ниже представлены меха-
(а)
« s
3
£ о
о «
m
IS
м
ce «
ce «
m ce ft
S
о
m
100
80
60
40
20
д"
H о
о «
m
IS
м
ce «
ce M о <D F
IS
s
4
о «
5 ft vo S
Ф
100
80
60
40
20
10 20 30
Время, мин
40
10 20 30
Время, мин
40
Рис. 1. Динамика эстеразной (а) и фибринолитической (б) активностей при взаимодействии 9.4 мкМ плазминогена со стрептокиназой (кривые 1) и стафилокиназой (кривые 2) в эквимолярных концентрациях (0.1 М фосфатный буфер, рН 7.4, содержащий 0.15 М NaCl, (37°C)).
низмы активации плазминогена человека стрептокиназой [18] и стафилокиназой [6] (схема)
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.