научная статья по теме Стресс-протекторная активность синтетического АСТН-подобного пептида лейкокортикотропина Химия

Текст научной статьи на тему «Стресс-протекторная активность синтетического АСТН-подобного пептида лейкокортикотропина»

т

ПИООРГЛ НИ ЧЕС К ЛЯ ХИМИЯ. 2006. том 32. №5. с. 477^(84

УДК 5 17.112.6+577.175.53

СТРЕСС-ПРОТЕКТОРНАЯ АКТИВНОСТЬ СИНТЕТИЧЕСКОГО АСТН-ПОДОБНОГО ПЕПТИДА ЛЕЙКОКОРТИКОТРОПИИА

© 2006 г. В. И. Ванина*, 10. Л. Ковалицкая*, А. А. Колобов**, Е. А. Кампе-Немм**, Ю. Л. Золотарев***, В. В. Юровский****, В. М. Липкин*, Е. В. Наволоцкая**

* Филиал Института биоорганической химии им. ММ. Шемякина и К).А. Овчинникова /'ЛИ: 142290. Московская область, г. Пущино, просп. Науки, (>; **П1Ц Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов,

Санкт- Петербург; ***Институт молекулярной генетики РАН, Москва; * * * * Медицинский факультет университета Мэриленд, Бсшпимор, США Поступила в редакцию 14.11.2005 г. Принята к печати 12.12.2005 г.

Установлено, что меченный тритием синтетический АСТН-подобный октапептид лейкокортико-тропин (ГТПСКУЬКККК). соответствующий аминокислотной последовательности 81-88 предшественника интерлейкнна-1а. с высоким сродством и специфичностью связывается с рецептором АСТН коры надпочечников крысы I К,, 2.2 ±0.1 нМ). Показано, что данный пептид в диапазоне концентраций 1-1000 нМ не влияет на активность аденилатциклазы мембран коры надпочечников крысы. При троекратном ннтраназальном введении в дозах 10-20 мкг/животное лейкокортикотро-пин практически не изменял уровень окспкортикостеропдов (11-ОСБ) в надпочечниках крыс в отсутствие температурного воисн^-гьня. В тч же время при холодовом или тепловом шоке пептид отменял (доза 20 мкг/животное троекратно или значительно уменьшал (доза 10 мкг/животное троекратно) резкое возрастание содержания 11-ОС8 в надпочечниках, вызванное шоком. Таким образом, лейкокортикотропнн ^¡тэдн нормализовать уровень 11-ОС8 к коре надпочечников крысы при стрессе. Стресс-протекторное действие пептида осуществляется через рецептор АСТН.

Ключевые слова: идренокорпшкотропный гормон, интерлейкин-1, пептиды, рецепторы, кора надпочечников.

ВВЕДЕНИЕ

Ранее 111 нами было обнаружено, что фрагмент 81 —88 предшественника 1штерлеикина-1и (plL-loc) человека ((Ж-VLKKRRi более чем на 80% подобен фрагменту АСТН-( 10-18) iCk-PVGKKRR). Мы синтезировали пктапептид GKVLKKRR (авторское название - лейкокорти-котропин, LCT) и показали, что он высоким сродством и специфичностью связывается с рецептором АСТН на спленоцитах н макрофагах мыши.

Основная функция АСТН состоит в спгмуля-ции синтеза и секреции глюкокортикоизов клетками пучковой и сетчатой зон коры нал почечников (для перевода: adrenal zona fasciculata/reticu-laris cells). Чувствительность клеток коры к АСТН зависит от экспрессии и Ф\ нкшш (.'бе-

Сокращеиии: АСТН - адренокортнк<ггр<кши* гормон: pll -1и - предшественник иитерлейкнна- 1а. РАМ - фея.шил.;-мидомстил;НРАА-ос1> гиноталамус-i шкафт-ядс» »чечнн-ки: II-OCS - 1I-оксикортикоегерошш; SUM - стжадлртиая ошибка среднего, " Автор для связи (тел.: (27) 7 V66-fiS. факс: Т>) • 3-»6-2": j.<i. почта: navoloisfg;I'ibkh.serpuk hov.su

локсвязанного рецептора (меланокортин-2-ре-цептор, МС2И), принадлежащего к подсемейству мелаиокортиновых рецепторов [2-5]. Связывание гормона с МС21^ приводит к увеличению активности аденилатциклазы и. как следствие, к активации протеинкиназы А [6-81. Капас и соавт. исследовали связывание фрагментов АСТН с клонированным мышиным рецептором гормона, экспресснрованным в человеческих клетках НеЬа [9]. Согласно полученным ими данным, фрагмент АСТН-( 11-24) активно конкурировал с '^¡-меченным АСТН за связывание (величина /М1 составляла приблизительно 1 нМ), но, в отличие от полноразмерного гормона, не обладал способностью активировать аденилагциклазу, т.е. проявлял свойства антагониста.

Поскольку, как мы показали 11 ]. ЬСТ имеет высокое сродство к рецептору АСТН иммуноком-петентных клеток, интересно выяснить, способен ли он связываться с рецеп тором АСТН коры надпочечников п каково его влияние на активность аденилатциклазы и содержание глюкокортикои-дов в надпочечниках лабораторных животных.

478

ВАНИНА и др.

АСТН HprolL-1 <х-{81 -109) MprolL-la-(81-109) RprolL-l<x-(81-109) LCT

1 10 20 30

SYSMEHFRWGKPVGKKRRPVKVYPNGAEDESAEAFPLEF

81 90 100

-GK-VLKKRRL3LSQSITDDD LEA1ANDSEA-

81 90 100

-GK-1LKKRRLS FSETFTE DDLQSITHDLEA-

81 90 100

—GK-ILKKRRLSLNQPITDVDLETNVSDPEL-1 8 GK-VLKKRR

Рис. 1. Сравнение аминокислотных последовательностей АСТН человека, фрагментов предшественников интерлей-кнна-1(Х человека - HprolL- la. мыши - MprolL-l«, крысы - RproIL- la и LCT. Совпадающие аминокислотные остатки выделены жирным шрифтом.

Цель настоящей работы - получение [ !H]LCT и изучение его связывания с мембранами коры надпочечников крысы, а также исследование влияния LCT на продукцию сАМР и глюкокорти-кондов клетками коры надпочечников крысы в норме и при холодовом и тепловом шоке.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Оси гипоталамус-гипофиз-надпочечники (the hypothalamus-piluitary-adrenal axis. НРАА) принадлежит центральная роль в регуляции стресс-реа-лизующих систем организма [10]. Любое стрес-сорное воздействие вызывает увеличение синтеза и секреции в гипоталамусе кортикотропнн-рилизинг-гормона (CRH) [I I. 12]. CRH по воротной системе сосудов поступает в переднюю долю гипофиза (аденогипофиз), где связывается со специфическими рецепторами (CRHR1 и CRIIR2) кортикотропных клеток (или клеток предшественника АСТН - проопиомеланокортина, РОМС). Показано. что экспрессия этих рецепторов при стрессе возрастает [13]. CRH - главный стимулятор синтеза и секреции РОМС [14]. Освобождающийся в кровеносное русло АСТН достигает надпочечников. связывается со специфическим С-белоксвязан-ным рецептором клеток пучковой и сетчатой зон коры [4.5J и индуцирует синтез и секрецию глюко-кортикоидов. которые по принципу отрицательной обратной связи иигибируют синтез и секрецию CRH и АСТН (РОМС) 115," 16|.

Недавно в гипоталамусе человека была обнаружена мРНК рецептора АСТН (MC2R), что позволило высказать предположение, что АСТН может регулировать свою собственную секрецию через ультракороткую петлю обратной связи гипофиз-гипоталамус |17|. Действие глюкокорти-коидов при стрессе направлено на мобилизацию защитных сил организма (освобождение катехо-ламинов, активацию ферментов глюконеогенеза, усиление липолиза, подавление белкового синтеза. увеличение секреции глюкагона, снижение секреции инсулина и т.д.) [ 18].

Сравнение аминокислотных последовательностей АСТН человека и фрагментов предшественника 1Ь-1а (р!Ь-1а) человека, мыши и крысы (рис. I) показывает, что наибольшую степень подобия с АСТН (фрагмент 10-18) имеет фрагмент 81-88 р!Ь-1ос человека (последовательность ЬСТ): он отличается от соответствующих фрагментов р1Ь-1а мыши и крысы одной эквивалентной заменой в позиции 83 (Уа1/11е). Таким образом. р1Ь-1а содержит высоко консервативную АСТН-подобную последовательность - фрагмент 81-88. Пептид, соответствующий этому фрагменту или включающий его, может, наряду с 11.-1 а. образовываться при процессинге р!Ь-1сх.

Мы получили [3Н]ЬСТ и изучили его связывание с мембранами, выделенными из коры надпочечников крысы. Эксперименты показали, что в выбранных нами условиях (см. раздел "Эксперимент. часть") [*Н|ЬСТ специфически связывается с мембранами коры надпочечников крысы (рис. 2). Из рис. 2а видно, что при 4°С динамическое равновесие в системе меченый пептид-рецептор устанавливалось примерно через 1 ч и сохранялось не менее 2 ч. Поэтому для определения величины равновесной константы диссоциации (К^) реакцию связывания [3Н]ЬСТ с мембранами проводили в течение I ч. Неспецифическое связывание [3Н |ЬСТ в этих условиях составляло 8.4 ± 1.6% от величины его общего связывания.

График Скэтчарда(график /). приведенный на рис. 26, показывает, что [-Н]ЬСТ связывается с одним типом высокоаффинных рецепторов на мембранах коры надпочечников (Кй комплекса рН]ЬСТ-рецептор составила 2.1 ± 0.2 нМ). Для характеристики специфичности связывания [3Н]ЬСТ в качестве потенциальных конкурентов были протестированы немеченые АСТН-(4-10)-. АСТН-(1—24)-, АСТН-(11-24)-нептиды. сомато-статнн. [З-эндорфин и [ МсС]энкефалпн. Результаты экспериментов, представленные в табл. 1. показывают, что только АСТН-(1-24) и АСГН-(1 I-24) иигибировали специфическое связывание [3Н ]ЬСТ с мембранами коры надпочечников (соот-

ветствующие значения К, 1.7 ± 0.1 и 1.9 ± 0.2 пМ). Ингибнрующая активность остальных пептидов была крайне низкой (К, > 10 мкМ).

По данным Капас и соавч. [9]. фрагмент АСТИ-( 11-24) является антагонистом рецептора АСТН: он активно конкурирует с '-^-меченным АСТН за связывание с клонированным рецептором гормона (ICÍ0 ~ 1 нМ). но. в отличие от АСТН, не активирует аденилатцнклазу. Мы получили '-^-меченный АСТН-( 11-24) п установили, что он с высоким сродством связывается с рецептором АСТН на мембранах коры надпочечников крысы /С,! - 1.8 ± 0.1 нМ (график 2 на рис. 2с>). Исследование специфичности связывания показало, что только LCT и АСТН-(1-24) вытесняли :?1-меченный АСТН-(11-24) из комплекса с рецептором (К, 2.0 ± 0.1 и 1.9 ± 0.1 нМ соответственно) (табл. 2). Остальные немеченые пептиды. протестирован-ные в качестве потенциальных конкурентов -АСТН-(4-10), соматостатин. [5-эндорфнн. [Ме(5|эн-кефалин были не активны [К, > 10 чкМ). Следует отметить, что в двух различных тест-системах (в первой в качестве меченого лиганда был использован | (HJLCT. во второй - '-Т-меченнын АСТН-( 1I-24)) были получены практически совпадающие значения Втм - 1.064 ± 0.128 и 1.056 ± 0.116 пмоль/мг белка соответственно. Это свидетельствует в пользу того, что полученные с помощью данных тест-систем кинетические характеристики связывания близки к истинным значениям. Таким образом, LCT и АСТН-( 11-24) связываются с рецептором АСТН на мембранах коры надпочечников крысы. Эксперименты показали, что связывание LCT с мембранами коры надпочечников не влияет на активность аденилатциклазы I т.юл. 3». Следовательно. как и АСТН-< 11-241. LCT является антагонистом рецептора АСТН.

Противовоспалительный цитокин IL-1 [19-21| и его рецепторы [ 20.22,23 J постоянно экспресснруют-ся клетками иммунной системы, а также нейронами н глиальными клетками головного мозга человека и

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Химия»