БИООРГЛНИЧЕСКЛЯ ХИМИЯ, 2009, том 35, № 1, с. 25-29
УДК 517.112.6+577.175.53
СТРЕСС-ПРОТЕКТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ СИНТЕТИЧЕСКОГО ПЕПТИДА KKRR, СООТВЕТСТВУЮЩЕГО ФРАГМЕНТУ 15-18 АДРЕНОКОРТИКОТРОПНОГО ГОРМОНА ЧЕЛОВЕКА
© 2009 г. В. Б. Садовников*, А. И. Сажин*, Ю. А. Золотарев**, Е. В. Наволоцкая*#
*Филиал Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 142290,
Московская обл., г. Пущино, просп. Науки, 6; **Институт молекулярной генетики РАН, Москва Поступила в редакцию 02.04.2008 г. Принята к печати 29.04.2008 г.
Изучена активность синтетического пептида KKRR, соответствующего аминокислотной последовательности 15-18 адренокортикотропного гормона (ACTH) человека, и его аналогов KKKK, RRRR, RRKK, kKRR, KkRR, KKrR, KKRr (строчной буквой обозначены аминокислоты D-ряда) при холодовом и тепловом шоке у крыс in vivo. Установлено, что интраназальное введение пептида KKRR в дозе 2-10 мкг/жи-вотное за сутки до шока предотвращает резкое возрастание уровня кортикостерона в надпочечниках и плазме крови крыс, вызванное температурным воздействием. Показано, что аминокислотные замены в пептиде KKRR приводят к резкому снижению активности: аналоги пептида проявляли низкую стресс-протекторную активность и обладали низким сродством к рецептору ACTH.
Ключевые слова: адренокортикотропный гормон (ACTH), пептиды, рецепторы; аденилатцикла-за; кора надпочечников, стресс.
ВВЕДЕНИЕ
Стресс (от английского "stress" - напряжение) -это одна из общих неспецифических нервно-гуморальных реакций организма человека и животных на действие "чрезвычайных" раздражителей (стрессоров), которая в основном определяется деятельностью гипоталамуса, гипофиза и надпочечников. Стресс имеет защитное значение и направлен на восстановление нарушенного гомеостаза. В условиях резкого изменения климата, ухудшения экологической обстановки, непрерывного возрастания психоэмоциональных нагрузок изучение молекулярных механизмов стресса стало одним из важнейших направлений исследования современных биологии и медицины. Ранее [1, 2] нами с целью поиска новых эффективных и безопасных средств, способных повысить адаптационные возможности организма и защитить его от негативного действия экстремальных факторов внешней среды, были синтезированы пептиды с ACTH-подобной структурой и исследована их активность in vitro и in vivo. Изучение рецепции пептидов показало, что ACTH-(15-18) (KKRR) - это самый короткий фрагмент ACTH, способный связываться с рецептором гормона. Пептид KKRR с высоким сродством и специфичностью связывался с мембранами коры надпочечников крысы (для комплек-
Сокращения: ACTH - адренокортикотропный гормон; SEM -стандартная ошибка среднего. #Автор для связи (тел.: (4967) 73-66-68; факс: (4967) 33-05-27; эл. почта: navolots@fibkh.serpukhov.su).
са [3H] KKRR-рецептор - Kd = 2.1 нМ), но не влиял на активность аденилатциклазы, т.е. действовал как антагонист ACTH.
Цель настоящей работы - исследование действия пептида KKRR и его аналогов при холодовом и тепловом шоке у крыс in vivo и анализ связи между структурой пептидов и их активностью.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Американские исследователи Коста и соавт. [3] получили аналоги ACTH-(1-24) с аминокислотными заменами остатков Lys и Arg на Ala в области 15-18 (K15A;R17A, K16A;R17A и K16A;R18A) и показали, что они обладают низкой активностью in vivo: соответственно 14, 8 и 9% от активности нативного ACTH (1-24). Сравнительный анализ первичной структуры ACTH позвоночных показал, что область молекулы 15-18 (KKRR) эволюционно высоко консервативна. Коста и соавт. предположили, что этот участок необходим для связывания с рецептором и (или) дальнейшей активации аденилатциклазы.
Нами с целью определения фрагмента ACTH наименьшей длины, способного с высоким сродством связываться с рецептором ACTH, были синтезированы пептиды - фрагменты ACTH-(11-24) и исследована их способность ингибировать специфическое связывание [3H]ACTH-(11-24) с мембранами коры надпочечников крысы [1, 2]. Оказалось, что самым коротким активным пептидом является ACTH-(15-18) (KKRR) (Ki 2.3 ± 0.2 нМ). Был полу-
26
САДОВНИКОВ и др.
Таблица 1. Влияние введения пептида ККЯЯ крысам на содержание кортикостерона в надпочечниках и плазме крови при холодовом и тепловом шоке*
Воздействие шока Введение KKRR, мкг/крыса Содержание кортикостерона**, %
Надпочечники Плазма
- - (ФР) 100 ± 10 (112.8 ±11.3 мкг/г) 100 ± 12 (40.7 ± 4.8 мкг/мл)
- 10 (ФР) 98.1 ± 9.2 97.4 ± 9.3
Холодовой шок - (ФР) 210.6 ± 9.3 160.3 ± 10
10 97.3 ± 10.5 100.7 ± 9.0
5 100.4 ± 9.4 105.2 ± 10.1
2 107.2 ± 8.6 111.4 ± 11.0
1 128.4 ± 8.4 118.3 ± 10.8
Тепловой шок - (ФР) 306.1 ± 8.8 192.3 ± 9.8
10 103.9 ± 9.1 101.0 ± 10.2
5 105.6 ± 10.1 108.5 ± 11.0
2 110.2 ± 9.9 114.3 ± 10.6
1 129.1 ± 10.6 125.6 ± 10.7
* ФР - введение физиологического раствора; прочерк означает отсутствие воздействия (шока или введения пептида). ** P < 0.02.
чен [3Н]АСТН-(15-18) и показано, что он с высоким сродством и специфичностью связывается с адрено-кортикальными мембранами (К 2.1 ± 0.1 нМ). Мы показали также, что АСТН-(15-18)-пептид не влияет на активность аденилатциклазы, т.е. является антагонистом АСТН.
Основная функция АСТН в организме состоит в стимуляции синтеза и секреции глюкокортикоидов клетками пучковой и сетчатой зон коры надпочечников [4-6]. При стрессе уровень АСТН в крови возрастает, что приводит к увеличению секреции глюкокортикоидов и, как следствие, освобождению катехо-ламинов, активации ферментов глюконеогенеза, усилению липолиза, подавлению белкового синтеза, увеличению секреции глюкагона, снижению секреции инсулина и т.д. [7]. В результате развивается особое состояние организма, получившее название "общий адаптационный синдром" [8]. Полагая, что пептид КККЯ при введении в организм будет действовать как антагонист АСТН, мы исследовали его влияние на содержание глюкокортикоидов (кортикостерона) в надпочечниках и плазме крови крыс в норме и при температурном воздействии. В отсутствие термического воздействия пептид практически не влиял на уровень гормона в железе и плазме (табл. 1). Холодо-вой шок приводил к значительному увеличению содержания кортикостерона в надпочечниках и крови, а интраназальное введение пептида в дозе 10 мкг/жи-вотное за сутки до шока отменяло этот эффект. Аналогичное протекторное действие пептида КККЯ наблюдалось и при тепловом шоке: при интраназаль-ном введении в дозе 10 мкг/крыса за сутки до шока он предотвращал резкое возрастание уровня кортикостерона в надпочечниках и плазме, вызванное
тепловым воздействием. Дальнейшие исследования показали, что пептид KKRR активен и в более низких концентрациях 5, 2 и 1 мкг/животное и что его активность зависела от его дозы (табл. 1). Полученные результаты свидетельствуют о том, что при введении в организм пептид KKRR действует как антагонист ACTH.
При сравнительном исследовании стресс-протекторного действия пептида KKRR и его аналогов KKKK, RRRR и RRKK (интраназальное введение в дозе 5 мкг/крыса за сутки до холодового шока) показано (рис. 1), что активность аналогов была гораздо ниже, чем у пептида KKRR (соответственно 12.7, 13.3 и 20.7% от активности пептида KKRR). Аналоги, содержащие остаток D-аминокислоты (kKRR, KkRR, KKrR, KKRr), также проявляли очень низкую активность (рис. 2). Дальнейшие исследования показали корреляцию между стресс-протекторной активностью пептидов и их сродством к рецептору ACTH.
Для оценки сродства пептидов к рецептору ACTH была изучена способность немеченых ACTH-(1-24), ACTH-(11-24), ACTH-(15-18) и его аналогов ингибировать специфическое связывание [3H]ACTH-(15-18) с мембранами коры надпочечников крысы. Результаты эксперимента, приведенные в табл. 2, показывают, что аналоги ACTH-(15-18) с заменой остатка Arg на Lys (KKKK) и Lys на Arg (RRRR), а также аналог RRKK проявляли соответственно в 12.4, 11.3 и 11.9 раз меньшее сродство к рецептору, чем ACTH-(15-18). Аналоги, содержащие остаток ¿-аминокислоты (kKRR, KkRR, KKrR, KKRr), обладали в 38-40 раз меньшей ингибирующей активностью, чем немеченый ACTH-(15-18). Суммируя полученные результаты с данными Коста и соавт. [3], можно сделать
350 г
250
, 300
св К
О &
о н о
О и м !Е
н 200
м J;
u н к
ce *
&
О
и о
О
w 150
100
50
Контроль Холод.
шок
Холод.
шок +
P1
Холод.
шок +
P2
Холод.
шок +
P3
Холод.
шок +
P4
Рис. 1. Влияние пептидов RRRR ^1), KKKK ^2), RRKK (P3) и KKRR (P4) на уровень кортикостерона в надпочечниках крыс при холодовом шоке. Пептиды вводили интраназально в дозе 5 мкг/животное за сутки до шока.
следующее заключение: участок 15-18 ACTH необходим для связывания с рецептором, аминокислотные замены в нем приводят к резкому снижению ре-цепторной активности.
Таким образом, пептид KKRR обладает высокой стресс-протекторной активностью и может быть использован для создания антистрессорных препаратов.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовали пептиды ACTH-(4-10), ACTH-(1-24) (Sigma, США), сахарозу, бычий сывороточный альбумин, EDTA, EGTA, Трис, фенилме-тилсульфонилфторид (PMSF), азид натрия (NaN3) (Serva, Германия), сцинтиллятор Unisolv 100 (Amer-sham, Англия). Остальные реактивы имели квалификацию "ос. ч.". Дистиллированную воду дополнительно очищали с помощью системы Мою-Q (Milli-pore, США).
Половозрелых крыс-самцов линии SD весом 180-210 г получали из питомника ФИБХ РАН.
Пептид ACTH-(15-18) (KKRR) и его аналоги (KKKK, RRRR, RRKK, kKRR, KkRR, KKrR, KKRr) были синтезированы на автоматическом синтезаторе Applied Biosystems, модель 430A (США), с использованием Boc/Bzl-тактики наращивания пептидной цепи как описано ранее [1]. Чистота пептидов после очистки превышала 97%. Молекулярную массу пептидов определяли с помощью масс-спектрального анализа (масс-спектрометр Finnigan, США). Данные аминокислотного анализа
(гидролиз 6 М HCl, 22 ч, 110°C; аминокислотный анализатор LKB 4151 Alpha Plus, Швеция) соответствовали заданным структурам.
Меченый аналог [3H]ACTH-(15-18) получали реакцией высокотемпературного твердофазного каталитического изотопного обмена как описано ранее [1, 2].
Мембраны из к
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.