БИОХИМИЯ, 2009, том 74, вып. 6, с. 761 - 767
УДК 577.121.7
СТРЕСС, ВЫЗЫВАЕМЫЙ ВЫСОКИМИ КОНЦЕНТРАЦИЯМИ СОЛЕЙ, В СОПРЯЖЕННЫХ И РАЗОБЩЕННЫХ МЕМБРАНАХ ТИЛАКОИДОВ: СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ*
© 2009 г. П. Мехта1, A. Яджу1**, С. Матур1, С.И. Аллахвердиев2, С. Бхарти1
1 School of Life Sciences, Devi Ahilya University, Indore 452 017, M.P, India; fax: (91731)247-7166, E-mail: anjanajajoo@hotmail.com
2 Institute for Basic Biological Problems, Puschino, Moscow Region, Russia
Поступила в редакцию 13.10.08 После доработки 11.12.08
Исследовали влияние высоких концентраций солей на скорости переноса электронов фотосистемой II (ФС II) и кинетику флуоресценции, индуцируемую хлорофиллом a (Хл a) в сопряженных и разобщенных мембранах тилакоидов шпината. Увеличение концентрации соли в большей степени воздействует на скорости транспорта электронов, опосредуемого ФС II, и на отношение Fv/Fm в разобщенных тилакоидах в сравнении с сопряженными тилакоидами. По-видимому, при высокой концентрации NaCl (~1 M) разобщенные мембраны тилакоидов ведут себя как сопряженные мембраны. Было обнаружено, что при повышении концентрации соли разобщитель менее эффективен и, возможно, Na+ действует как агент, усиливающий сопряжение или подавляющий разобщение. Мы считаем, что, вызывая сопряженное состояние, положительный заряд Na+ имитирует функцию положительного заряда H+ в люмене тилакоидов. Функция NaCl (моновалентный катион) может быть выполнена даже при более низких концентрациях Ca2+ (двухвалентный катион) или Al3+ (трехвалентный катион). Мы заключили, что эта функция NaCl как агента, усиливающего сопряжение, не является специфической и, в целом, для того чтобы создать сопряжение в разобщенных мембранах тилакоидов, требуется положительный заряд.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: стресс, вызываемый высокими концентрациями солей; разобщитель, ФС II и ФС I; транспорт электронов; мембраны тилакоидов.
Стресс, вызываемый высокими концентрациями солей, представляет собой основной фактор, ограничивающий продуктивность сельскохозяйственных культур. Снижение в росте растений и, в связи с этим, сниженная урожайность, часто связаны с ослаблением фотосинтеза. Фотосинтез — это процесс, с помощью которого зеленые растения, эукариотические водоросли, цианобактерии и некоторые другие прокариоты преобразуют энергию света в химиче-
Принятые сокращения: DCPIP — 2,6-дихлорфено-линдофенол; DCMU — 3-(3,4-дихлорфенил)-1,1-диметил-мочевина; EDTA — этилендиаминтетраацетат; Fm — максимальная флуоресценция; Fv — переменная флуоресценция; КВК — кислородвыделяющий комплекс; ФС I — фотосистема I; ФС II — фотосистема II; QA (QB) —первичный (вторичный) хинонный акцептор; РЦ — реакционный центр.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 08-328.
** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
скую энергию. Он включает две реакции: световую и темновую. Первичные компоненты световой реакции представляют собой фотосистему I (ФС I) и фотосистему II (ФС II). ФС II - это по-лисубъедининчный интегральный мембранный белковый комплекс, используемый высшими растениями и цианобактериями для катализа окисления воды и восстановления пластохино-на [1]. Центральное ядро ФС II включает гетеро-димер белков и Б2, два белка, содержащие хлорофилл, СР43 и СР47, Су! Ь559 и, со стороны люмена, комплекс окисления воды или кисло-родвыделяющий комплекс, содержащий четыре атома Мп на РЦ, стабилизированный магнием периферический 33 кДа-белок, периферический 17 кДа-белок и дополнительный 24 кДа-белок [2]. ФС I, главным образом, обнаруживают в несложенном участке мембраны тилакоидов. ФС I действует как движимая светом пластоцианин: ферредоксин-оксидоредуктаза [3], состоящая, главным образом, из реакционного центра (РЦ) и светособирающего комплекса (ССК) I [4].
Основная функция ФС II заключается в обеспечении переноса электронов от воды, окисляющей марганцевый кластер, который находится на стороне люмена, к пластохинону (PQ), который находится на стороне стромы мембраны тилакоидов, что приводит к образованию трансмембранного градиента протонов [5]. Положительный заряд, образованный ФС II, окисляет воду до молекулярного кислорода, тогда как отрицательный заряд восстанавливает пластохинон до пластохинола. Четыре протона от двух молекул воды освобождаются в люмене мембраны тилакоидов. Пластохинол также освобождает протоны в люмене тилакоидов в ходе переноса электрона на комплекс Cyt b6f. Протонный градиент, образовавшийся на мембране тилакоидов в результате транспорта электронов, используется для синтеза ATP.
ФС II, в сравнении с ФС I, более чувствительна к таким видам стресса как изменения pH и температуры, засуха, недостаточность питательных веществ, облучение, осмотический стресс и стресс, вызываемый высокими концентрациями солей [6]. Стресс, вызываемый высокими концентрациями солей, приводит к ряду изменений в биосинтетических функциях, включающих фотосинтез, фотодыхание, синтез аминокислот и углеводов [7—9]. Солевой стресс ингибирует активность ФС II в высших растениях [10]. В клетках Synechococcus 0,5 M NaCl снижает скорости транспорта электронов, катализируемого как ФС II, так и ФС I, в результате изменения в соотношении K/Na [11]. Солевой стресс не только приводит к снижению действительной эффективности ФС II (Ф [ФСщ), эффективности энергии возбуждения, захваченной открытыми реакционными центрами ФСП (F[v]'/F[m]'), и коэффициентов фотохимического тушения (qp), но и вызывает увеличение в нефотохимическом тушении флуоресценции [12]. Увеличение количества натрия может вызывать ионную токсичность и нестабильность мембраны, связанную с вытеснением кальция [13].
В люмене тилакоидов скорость транспорта электронов сопряжена с транслокацией протонов. Более высокая концентрация протона в люмене тилакоидов вызывает снижение в скорости транспорта электронов. Не известно, связано это падение со снижением pH люмена [14] или возникает благодаря аккумуляции положительного заряда в люмене тилакоидов. Разобщение, как правило, связано с выходом протона из люмена тилакоидов, что приводит к рассеиванию протонного градиента и к значительному увеличению в скоростях транспорта электронов в ФС II [15]. В настоящей работе мы исследовали влияние стресса, вызываемого высокими
концентрациями солей, в сопряженных и разобщенных мембранах тилакоидов с целью установить роль ионов натрия и других катионов как агентов, усиливающих сопряжение.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Получение мембран тилакоидов. Мембраны тилакоидов получали из купленного на рынке шпината (Spinacea oleracea), по описанному ранее методу [16]. Все стадии выполняли при температуре 0—4° при неярком зеленом свете. Мембраны тилакоидов перед использованием хранили в 50%-ном глицерине в жидком азоте. Концентрацию хлорофилла определяли с помощью традиционного метода [17].
Солевая обработка. Хранившиеся мембраны тилакоидов медленно размораживали при 0—4° и промывали буфером 50 мМ MOPS-NaOH, pH 7,5 для того, чтобы создать условия осмотического шока. Затем мембраны суспендировали в 0,33 M сахарозе и 50 мМ MOPS-NaOH (pH 7,5). Суспендированные мембраны тилакоидов инкубировали в темноте в течение 15 мин в присутствии соли (NaCl) в различных концентрациях: 50, 100, 200, 400, 600, 800 и 1000 мМ. Такие, обработанные в присутствии соли мембраны тилакоидов применяли для измерения различных параметров.
Скорости транспорта электронов, катализируемого ФС II. Скорости катализируемого ФС II транспорта электронов измеряли в мкмолях восстановленного красителя • (мг Хл)-1 час-1 при измерении фотовосстановления красителя DCPIP (H2O ^ DCPIP) спектрофотометрическим методом (спектрофотометр «Perkin-Elmer Bio 10») при 605 нм. Реакционная среда состояла из 0,33 M сахарозы, 50 мМ MOPS-NaOH (pH 7,5), 35 мкМ DCPIP и суспензии тилакоидов, в концентрации равной 10 мкг • Хл/мл. Реакционная смесь для разобщенных мембран тилакоидов состояла из тех же компонентов, что описано выше, но дополнительно содержала 10 мМ NH4Cl.
Измерение флуоресценции. Кинетику индуцируемой хлорофиллом a (Хл a) флуоресценции измеряли с помощью анализатора эффективности растений (PEA, Hansatech, Великобритания). Реакционная смесь состояла из 0,33 M сахарозы, 50 мМ MOPS-NaOH (7,5) и суспензии тилакоидов, равной 10 мкг Хл/мл.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Скорости катализируемого ФС II транспорта электронов измеряли в сопряженных и разобщенных мембранах тилакоидов. При изучении
влияния разобщителя (МИ4С1), взятого в различных концентрациях, на катализируемый ФС II и ФС I перенос электронов было найдено, что оптимальная концентрация разобщителя равна 10 мМ (данные не приведены). Функция разобщителя заключается в удалении протона из люмена тилакоида, что приводит к нарушению связи между транспортом электронов и фосфо-рилированием, в результате чего скорости транспорта электронов значительно вырастают [18].
Увеличение концентрации соли приводит к значительному снижению скорости катализируемого ФС II переноса электронов в разобщенных мембранах тилакоидов (рис. 1), тогда как в случае сопряженных мембран тилакоидов наблюдали очень незначительное снижение. Увеличение концентрации №С1 с 50 мМ до 100 мМ вызывает увеличение скорости транспорта электронов в ФС II (И20 ^ БСР№). Концентрации моновалентного и двухвалентного катионов в большей части исследований, касающихся регуляции фотосинтетических процессов катионами, были равны 100—200 и 5—20 мМ соответственно. Было показано, что при концентрации соли вплоть до 200 мМ (моновалентный катион), преобладали эффекты катиона [19, 20]. Это приводило к увеличению в скоростях ФС II путем реорганизации общего заряда на мембране тилакоидов. Однако в результате нарушения равновесия в зарядах скорости транспорт электронов в ФС II начинают снижаться при дальнейшем увеличении концентрации №С1 (>200 мМ) и при 1 М №С1 скорости транспорта электронов в сопряженных и разобщенных мембранах тилакоидов становятся практически одинаковыми (~50 Ед.). Полученные данные могут свидетельствовать о том, что при высокой концентрации №С1 разобщенные мембраны
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.