БИОЛОГИЯМОРЯ, 2013, том 39, № 2, с. 106-114
УДК591.3595.124 ЭМБРИОЛОГИЯ
СТРОЕНИЕ АПИКАЛЬНОГО ОРГАНА И ПРИЛЕГАЮЩЕГО ЭПИТЕЛИЯ У PILIDIUM PRORECUR VATUM -ПЕЛАГИЧЕСКОЙ ЛИЧИНКИ НЕИЗВЕСТНОЙ ГЕТЕРОНЕМЕРТИНЫ (NEMERTEA)1
© 2013 г. А. В. Чернышев1'2, А. А. Астахова3, С. Ш. Даутов1, В. В. Юшин1-2
1Институт биологии моря им.А.В.ЖирмунскогоДВО РАН, Владивосток 690059;
2Далънееосточный федеральныйуниверситет, Владивосток 690600;
3Факультет биоинженерии и биоинформатикиМГУим.М.В. Ломоносоеа,Москеа 119991
e-mail: tsher@bio.dvgu.ru
Статья принята к печати 20.09.2012 г.
На основе материала, собранного в зал. Петра Великого Японского моря, приведены данные конфокальной лазерной сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии по морфологии пилидия из группы recurvatum. Изученные личинки отличаются от pilidium recurvatum отсутствием заднего венчика ресничек и наличием каудального султанчика. На этом основании для них предложено новое название - pilidium prorecurvatum. Апикальный орган пилидия представляет собой утолщенный эпителий, состоящий из столбчатых моноцилиарных воротничковых клеток одинакового строения и иннервируемый парой серотонинергических интраэпителиальных нейронов. Тела серотонинергических нейронов расположены вне апикального органа, но в его базальной части встречаются отдельные аксоны. Эпителий пилидия представлен уплощенными 4-6-угольными мультицилиарны-ми клетками с редкими микроворсинками; тела двух нейронов залегают в эпителии латерально, в непосредственной близости от апикального органа. Апикальный орган пилидия морфологически соответствует таковому личинок других Lophotrochozoa, однако их гомология остается неясной.
Ключевые слова: немертины, пилидий, pilidium, апикальный орган, нервная система, ультраструктура, конфокальная лазерная сканирующая микроскопия.
Morphology of the apical organ and adjacent epithelium of pilidium prorecurvatum, a pelagic larva of unknown heteronemertean (Nemertea). A. V. Chernyshev1-2, A. A. Astakhova3, S. Sh. Dautov1, V. V. Yushin1-2 (A..V. Zhirmunsky Institute of Marine Biology, Far East Branch, Russian Academy of Sciences, Vladivostok 690059; 2Far Eastern Federal University, Vladivostok 690600; 3Lomonosov Moscow State University, Moscow 119991)
The morphology ofpilidium ex gr. recurvatum from Peter the Great Bay (Sea of Japan) was studied by laser scanning confocal and transmission electron microscopy. The studied pilidium larvae differ from pilidium recurvatum in lacking a posterior ciliary ring and in having a caudal tuft. On this basis,pilidium prorecurvatum is proposed as a new name for them. The apical organ ofpilidiumprorecurvatum is represented by a thickened epithelium, which consists ofuniform columnar monociliary collar cells and is innervated by a pair of serotonergic intraepithelial neurons. The bodies of the serotonergic neurons are located outside the apical organ, but occasional axons were found at the organ base. The rest of the pilidial epithelium is represented by flattened polygonal multiciliated cells with sparse microvilli; the bodies of two neurons lie in the cupola epithelium immediately adjacent to the apical organ. Morphologically, the apical organ of the pilidium corresponds well to that of other lophotrochozoan larvae, but their homology remains unclear. (Biologiya Morya, 2013, vol. 39, no. 2, pp. 106-114).
Keywords: nemerteans,_p/ftafrara, apical organ, nervous system, ultrastructure, laser scanning confocal microscopy.
Пилидии - планкготрофные личинки немертин, характеризующиеся длительным развитием (до 1 мес. и более) и некробиотическим метаморфозом. Пилидии обнаружены у немертин отряда Heteronemertea, а также описаны у видов семейства Hubrechtellidae (Cantell, 1966; Norenburg, Strieker, 2002). В работах XIX века разным формам пилидиев присваивали латинские "видовые" названия, которые используются до сих пор. Различают 6 основных типов (или групп) пилидиев: pilidium magnum, р. pyramidale, p. gyrans, p. recurvatum, p. brachiatum и
р. auriculatum (Bürger, 1897-1907). Давыдов (Dawydoff, 1940) описал еще несколько пилидиев, которые не могут быть отнесены ни к одной из указанных групп.
Пилидии из группы recurvatum - одни из самых необычных личинок немертин. Типичный pilidium recurvatum был описан еще в XIX веке (Fewkes, 1883), однако до сих пор неизвестно, личинкой какого представителя отряда Heteronemertea он является. Несомненно лишь то, что гетеронемертины с таким типом личинок принадлежат не к семейству Lineidae, а к более базаль-
1 Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Правительства Российской Федерации для государственной поддержки научных исследо-
ваний, проводимых под руководством ведущих ученых в российских образовательных учреждениях (№ 11.034.31.0010), а также грантов РФФИ
№ 10-04-00570, 07-04-00547 и 11-04-98555-р_восток_а.
ной группе (Cantell, 1966; Чернышев, 2001). На это указывает наличие у ювенильных особей, развивающихся внутри пилидия, не длинных продольных, а очень коротких косых боковых щелей. Некоторые авторы (Jägersten, 1972; Иванова-Казас, 1995) считают, что pilidium recurvatum является исходным звеном в эволюции пилидиев. В таком контексте исследования пилидиев из группы recurvatum становятся особенно актуальными.
Интерес к строению и развитию пелагических личинок морских беспозвоночных, и прежде всего их нервной системы и апикального органа, можно объяснить большим значением нейрогенеза для понимания филогенеза многоклеточных и для исследования физиологии простых нервных систем (Richter et al., 2010). Апикальный орган характерен для личинок многих беспозвоночных, включая немертин. Исключением являются лишь развивающиеся внутри кладки дезоровские личинки Lineus (= Poseidon) viridis и L. ruber (Шмидт, 1962). В настоящей работе исследован апикальный орган pilidium prorecurvatum из зал. Петра Великого (Японское море) в связи с проблемой иннервации этого органа у пилидиев.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Личинки pilidium prorecurvatum получены из проб планктона, собранных в зал. Восток (зал. Петра Великого, Японское море) 30 июля -20 августа в 2004,2010 и 2011 гг. Личинок изучали как in -vivo, так и на тотальных препаратах. В последнем случае личинок фиксировали 4% формальдегидом на фильтрованной морской воде (ФМВ), затем их отмывали в проточной воде и заключали в глицерин. Для предварительного изучения общей морфологии и анатомии одну из личинок, подготовленных для трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ), использовали для изготовления серийных полутонких срезов (0.5-0.7 мкм), которые окрашивали метиленовым синим и заключали в смолы Спурра (Spurr, Sigma). Препараты изучали, используя микроскопы Reichert Polyvar и Leica DM4500B, а также фотографировали с помощью цифровой камеры Leica DC 150.
Для иммуноцитохимических исследований пилидиев фиксировали в растворе 4% формальдегида на ФМВ 1-1.5 ч при 4°С. После фиксации для повышения проницаемости мембран личинок на 15 мин помещали в 0.3% раствор Тритона Х-100 на фосфатном буфере (PBS) и отмывали в PBS. Для снижения неспецифического окрашивания личинок переносили в 10% раствор козьей сыворотки на PBS при 4°С; через 1 ч, добавив смесь растворов первичных мышиных антител на ацитили-рованный а-тубулин (ImmunoStar) и первичных кроличьих антител на серотонин (ImmunoStar) в PBS, их помещали на ночь в холодильник. После отмывки в PBS пилидиев на 3-4 ч помещали в смесь растворов А1еха488-конъюгированных козьих антител (Molecular Probes) на мышиные антитела (1/100 на PBS) и AlexaFluor 546-конъюгированных козьих антител (Molecular Probes) на кроличьи антитела (1/100 на PBS) (при комнатной температуре в темноте). Для окраски ДНК применяли растворы DAPI или Hoechst 33258, которые добавляли на 10 мин после удаления вторичных антител перед окончательной отмывкой. Личинок отмывали три раза по 10 мин в PBS, переносили на предметные стекла и заключали в смесь PBS с глицерином (1 : 1), содержащую 6.25 мг/мл п-пропилгаллата.
Для выявления актина (в мышцах и в клетках покровного эпителия) фиксированных таким же образом личинок окрашивали 2 ч в растворе фаллоидина, меченного А1еха-633, на PBS (1 : 200), отмывали в PBS и заключали в Moveol. Пилидиев сканировали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа LSM Zeiss Meta 510. Серии оптических срезов с шагом 0.5-1.5 мкм регистрировали и записывали при помощи программного обеспечения LSM 510, после чего генерировали трехмерные реконструкции.
Для ТЭМ личинок фиксировали при температуре 4°С в 2.5% глютаральдегиде на 0.05 М какодилатном буфере, содержащем 21 мг/мл NaCl, затем проводили дофиксацию 2% тетра-оксидом осмия на том же буфере. После промывки в буфере и контрастирования в течение 12 ч в 1% водном растворе ура-нилацетата материал дегидратировали в серии спиртов и изо-пропаноле, после чего заключали в смолы Спурра. Тонкие срезы, изготовленные на ультратомах Reichert Ultracut Е и Leica UC6, контрастировали 1% раствором уранилацетата в 10% этаноле, а затем цитратом свинца. Срезы изучали и фотографировали на электронном микроскопе ffiOL JEM 100В. Для исследования ультраструктуры использовали шесть экземпляров pilidiumprorecurvatum.
РЕЗУЛЬТАТЫ Внешняя морфология
Пилидий удлиненной формы, закругленный в задней части и уплощенный в области апикального органа (рис. 1А). Длина личинок на стадиях образования "имагинальных дисков" и непосредственно перед выходом ювенильной особи увеличивается с 380 до 460 мкм. Покровный эпителий пилидия ресничный, непигменти-рованный; при сокращении личинки на вентральной поверхности сжимается. На заднем конце пилидия эпителий заметно утолщен, несет более длинные реснички и тонкий каудальный султанчик (рис. 1А). Заднего венчика ресничек нет. Ротовая лопасть воронковидная, длиной 190-200 мкм, входное отверстие 60-70 мкм в диаметре, по краю обрамлена более длинными ресничками, при сокращении прижимается к телу пилидия и направлена назад. На переднем конце хорошо виден апикальный орган диаметром 40-45 мкм и толщиной около 15 мкм. Апикальный султанчик ресничек длиной 80-90 мкм направлен
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.