ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, Серия А, 2011, том 53, № 11, с. 1877-1884
ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТЫ
УДК 541(64+49):547.915
СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА КОМПЛЕКСОВ ПОЛИКАТИОННЫХ ЩЕТОК
С АНИОННЫМИ ЛИПОСОМАМИ1
© 2011 г. О. В. Заборова*, А. В. Сыбачин*, М. Ballauff*****, А. А. Ярославов*
*Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова.
Химический факультет 119991 Москва, Ленинские горы **Department of Physics, Humboldt University 12489 Berlin, Newtonstr. 15, Germany ***Helmholtz-Zentrum Berlin für Materialien und Energie 14109 Berlin, Hahn-Meitner-Platz 1, Germany Поступила в редакцию 25.02.2011 г.
Принята в печать 31.05.2011 г.
Исследована адсорбция анионных липидных везикул (липосом) на поверхности коллоидных частиц, содержащих привитые поликатионные цепи (катионных щеток). Устойчивость комплекса ли-посома—щетка к действию соли увеличивается с ростом содержания анионного липида в липосо-мальной мембране; при содержании анионного липида 20 и 30 мол. % комплексы не диссоциируют на составляющие компоненты в растворах с концентрацией NaCl до 1.2 моль/л. Целостность липосом в комплексе со щетками сохраняется. Предложенный подход может быть использован для получения наноразмерных носителей биологически активных веществ.
ВВЕДЕНИЕ
Использование сферических моноламелярных бислойных липидных везикул (липосом) в качестве контейнеров для транспорта биологически активных веществ имеет давнюю историю. Впервые на такую возможность обратили внимание авторы липосомальной технологии в середине прошлого столетия [1]. Гидрофобные вещества могут быть инкапсулированы в липосомальную мембрану, гидрофильные — во внутреннюю водную полость липосом [2, 3]. Несмотря на значительный прогресс в области создания липосо-мальных контейнеров, лишь немногие препараты были реализованы на практике [4]. Виной тому низкая термодинамическая стабильность липо-сом, высокая скорость их поглощения клетками ретикуло-эндотелиальной системы, ограниченная емкость липосомального контейнера, сложность придания ему векторных свойств и ряд других ограничений [5, 6]. Предпринимались попытки иммобилизовать липосомы на поверхности твердых носителей (имплантов) с целью локального концентрирования контейнеров и последующего высвобождения заключенного в них лекарства. Однако закрепление липосом на твердом
1 Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (код проекта 1103-00936).
E-mail: sybatchin@mail.ru (Сыбачин Андрей Владимирович).
носителе обычно сопровождалось их разрушением и неконтролируемым выходом лекарства [7]. Описанные в литературе удачные примеры закрепления липосом на поверхности, обеспечивающие сохранение их целостности, предполагают проведение достаточно сложных процедур предварительной модификации как липосом, так и поверхности [8].
Недавно нами был предложен способ иммобилизации (электростатической адсорбции) анионных липосом на поверхности коллоидных частиц, содержащих привитые поликатионные цепи (катионных щеток) [9], который позволяет концентрировать на поверхности значительное количество липосомальных контейнеров, не нарушая их целостности. В данной статье мы рассматриваем строение и свойства комплексов липосома-щет-ка, делая особый упор на стабильность слоя иммобилизованных липосом в солевых растворах, одного из ключевых факторов, определяющих возможность биомедицинского применения таких конструкций.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Кардиолипин (КЛ2-), фосфатидилхолин (ФХ) и дипальмитоилфосфатидилэтаноламин, меченный флуоресцеинизотиоцианатом (ДПФЭ-ФИТЦ), (все производства "Ауапй", США) использовали без дополнительной очистки.
Малые моноламелярные смешанные липосо-мы получали методом озвучивания. Необходимое количество растворов липидов в хлороформе смешивали, затем тщательно удаляли органический растворитель на вакуумном роторном испарителе "Rotavapor" ("Buchi", Швейцария) при 36°С. Образовавшуюся тонкую пленку липидов диспергировали в 2 мл 10—2 М боратного буферного раствора (рН 9.2). После этого на препарат воздействовали ультразвуком частоты 22 кГц в течение 600 с (2 х 300 с) в непрерывном режиме. Применяли ультразвуковой диспергатор 4710 ("Cole-Parmer", США). Полученные липосомы отделяли от титановой пыли на центрифуге J-11 ("Beck-man", США) в течение 5 мин при скорости вращения 12 х 103 об/мин. Мольную долю отрицательно заряженных полярных "головок" рассчитывали следующим образом: v = 2[КЛ2—]/(2[КЛ2—] + [ФХ]) (каждая молекула КЛ2— несет по две анионные группы). Для малых моноламелярных липосом размер (гидродинамический диаметр) колебался от эксперимента к эксперименту, но не выходил за пределы интервала 40-60 нм.
Липосомы со встроенной в бислой флуоресцентной меткой получали добавлением к смеси растворов липидов 0.2 мг ДПФЭ-ФИТЦ (1% от общей массы липидов). Липосомы с заключенным во внутренний объем хлоридом натрия готовили, диспергируя полученную пленку в 10-2 М боратном буфере, дополнительно содержавшем 1 М NaCl. Полученную суспензию диализовали в течение 2 ч против 10-3 М боратного буфера, который меняли каждые полчаса.
Сферические поликатионные щетки (СК+) синтезировали по методике [10] графт-полиме-ризацией триметиламиноэтилметакрилатаммо-ний хлорида на поверхности монодисперсных полистирольных латексных частиц с диаметром 100 нм [11]. Среднее число поликатионных цепей на частицу составляло 600, средняя длина цепей — 65 нм. Концентрация СК+ приведена в молях кватернизованных звеньев в литре раствора.
Воду для приготовления растворов очищали двойной перегонкой с дальнейшим последовательным пропусканием через ионообменные адсорбционные колонки и фильтр для удаления крупных частиц. Очищенная таким образом вода имела удельную электропроводность 0.6 мкСм/см.
Во всех экспериментах, если не оговорено иное, использовали 10-2 М боратный буферный раствор с рН 9.2.
Размер частиц (гидродинамический диаметр) определяли методом квазиупругого светорассеяния на приборе "ZetaPlus" ("Brookhaven" TI, США). Измерения проводили в термостатируе-мой кювете. Погрешность измерения 5%.
Электрофоретическую подвижность (ЭФП) определяли на приборе "ZetaPlus" ("Brookhaven"
TI, США). Измерения выполняли в термостати-руемой кювете, в которую был погружен электрод с напряжением 20 В; погрешность измерения 2%.
Интенсивность флуоресценции растворов оценивали на спектрофлуориметре F-3000 ("Hitachi", Япония); погрешность 2%.
Концентрацию флуоресцентно меченных липосом в растворе измеряли на спектрофлуориметре F-3000 ("Hitachi", Япония), сравнивая интенсивность флуоресценции образцов с калибровочной кривой. Погрешность измерения 3.5%.
Значения pH растворов находили с помощью рН-метра 210 ("Hanna", США). Измерительным электродом служил стеклянный электрод HI 1131B. Проводимость растворов определяли на кондуктометре CDM 83 ("Radiometer", Дания) с платиновым электродом PP1042. Погрешность измерения 5%.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Комплексообразование анионных липосом КЛ2—/ФХ с СК+ сопровождается нейтрализацией поверхностного заряда СК+, что может быть зарегистрировано по изменению ЭФП комплексов. На рис. 1 представлены зависимости ЭФП комплексов липосома—СК+ от концентрации везикул L для липосом с различной мольной долей анионных "головок" КЛ2— v от 0.05 до 0.30. Видно, что во всех случаях образование комплекса сопровождалось уменьшением поверхностного заряда СК+ и переходом его в отрицательную область при больших концентрациях липосом. Увеличение доли анионного липида в липосомаль-ной мембране требовало меньшего количества (концентрации) липосом для нейтрализации заряда СК+ и одновременно повышало максимальный отрицательный заряд, приобретаемый щеткой в избытке липосом (ЭФПмакс). При v = 0.05 нейтрализация заряда СК+ происходила при добавлении 0.86 мг/мл суспензии липосом, при v = 0.30 для этого требовалось 0.35 мг/мл липо-сом; первые липосомы создавали на поверхности СК+ слой с ЭФПмакс = —0.20 (мкм/с)/(В/см), вторые с ЭФПмакс = —2.77 (мкм/с)/(В/см).
Параллельное измерение размеров комплекса показало, что связывание липосом с СК+ сопровождается агрегацией частиц (рис. 2). Максимальный размер агрегатов достигался при полной нейтрализации поверхностного заряда СК+, т.е. при ЭФП, равной нулю. Последующее добавление липосом приводило к уменьшению размера частиц — он приближался к размеру исходных СК+. Очевидно, что стабилизация комплекса в избытке липосом была обусловлена появлением на поверхности частиц избыточного отрицательного заряда, привнесенного адсорбированными липосомами.
СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА КОМПЛЕКСОВ ПОЛИКАТИОННЫХ ЩЕТОК
1879
ЭФП, (мкм/с)/(В/см)
-3
1.5
X, мг/мл
Рис. 1. Зависимость ЭФП частиц в системе липосомы КЛ2 /ФХ—СК+ от концентрации добавленных липосом. Здесь и на рис. 2 и 3 V = 0.05 (1), 0.1 (2), 0.2 (3) и 0.3 (4); [СК+] = 1 х 10-4 моль/л; боратный буфер, 10-2 М, рН 9.2; Т = 20°С.
Гидродинамический диаметр, мкм 1.5
1.0
0.5
\ ■ 1
\ \ *2
_ щ V \ \ • з
\ Т А4
-Г 1 /
1 ^^иг-• —■--и - 1 1 1
0.2
0.6
1.0
1.4
X, мг/мл
Рис. 2. Зависимость среднего гидродинамического диаметра частиц в системе липосомы КЛ2 /ФХ—СК+ от концентрации добавленных липосом.
Связывание анионных липосом с линейными катионными полимерами может при определенных условиях повышать проницаемость липосо-мальной мембраны по отношению к низкомолекулярным ионам и незаряженным гидрофильным соединениям [12] и даже вызвать разрушение липосом [13]. Целостность липосом
ФХ/КЛ2- в комплексе с СК+ анализировали методом кондуктометрии. Для этого были приготовлены липосомы с минимальным и максимальным содержанием анионного липида (с V = 0.05 и 0.30), внутренний водный объем которых был заполнен 1 М раствором №С1. Нарушение целостности мембраны должно было сопровождаться
2_
Рис. 3. Зависимость концентрации липосом КЛ2 /ФХ в надосадочной жидкости от общей концентрации липосом в системе.
увеличением электропроводности липосомаль-ной суспензии. Полученный результат сравнивали с электропроводностью, измеренной в ходе контрольного эксперимента _ разрушения липосом в присутствии избытка детергента (Тритона Х-100), которую принимали за 100
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.