МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 3, с. 312-319
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.841.11.013:577.14.7
СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА ЛИПОПОЛИСАХАРИДА PSEUDOMONAS FLUORESCENS ИМВ 2366 (БИОВАР III)
© 2004 г. С. Н. Веремейченко*, Г. М. Здоровенко**
*Научно-производственная компания "Диапроф-Мед", Киев, Украина **Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев, Украина
Поступила в редакцию 20.12.02 г.
Препарат липополисахарида, выделенный из бактериальной массы Pseudomonas fluorescens ИМВ 2366 (биовар III) методом Вестфаля и очищенный повторным ультрацентрифугированием характеризовался присутствием S- и R-форм молекул. Получены в индивидуальном состоянии и охарактеризованы структурные части макромолекулы ЛПС: липид А, олигосахарид кора и О-специфичес-кий полисахарид. Основными компонентами гидрофобной части липида А были: 3-оксидекановая, 2-оксидодекановая, 3-оксидодекановая, додекановая и гексадекановая жирные кислоты. В качестве компонентов гидрофильной части липида А идентифицированы: глюкозамин, фосфоэтаноламин и фосфор. В составе фракций корового олигосахарида обнаружены: рамноза, глюкоза, галактоза, глюкозамин, галактозамин, аланин, фосфоэтаноламин, фосфор, 2-кето-3-дезоксиоктулозоновая кислота (КДО), а также 2-амино-2,6-дидезоксигалактоза (FucN) и 3-амино-3,6-дидезоксиглюкоза (Qui3N). Установлено, что О-специфические полисахаридные цепи построены из трисахаридных повторяющихся звеньев, состоящих из остатков L-рамнозы (L-Rha), 2-ацетамидо-2,6-дидезокси-0-галактозы (D-FucNAc) и 3-ациламидо-3,6-дидезокси-0-глюкозы (D-Qui3NAcyl), где Acyl = 3-окси-2,3-диметил-5-оксипролил. Методами двойной иммунодиффузии в агаре и иммуноферментного анализа не выявлены серологические взаимосвязи между исследуемым штаммом и штаммами P. flu-orescens, изученными ранее.
Ключевые слова: Pseudomonas fluorescens, липополисахарид, липид А, коровый олигосахарид, О-специфический полисахарид.
Бактерии вида Pseudomonas fluorescens - сапрофитные грамотрицательные микроорганизмы, для которых характерна гетерогенность по фено-типическим и генотипическим признакам. Согласно международной классификации бактерии этого таксона распределены на пять биоваров с неокончательно установленным таксономическим рангом [1]. Штаммы этих бактерий, относящиеся к биовару III (биотип C по Стейниеру [2]), как и другие представители вида, выделяются из различных источников (воды, почв, пищевых продуктов, ризосферы растений). Уровень гомологии ДНК штаммов P. fluorescens (биовар III) и штаммов, представляющих другие биовары вида достигает 60% [3]. Уровень сходства по данным строения липополисахаридов (ЛПС), выделенных из бактерий отдельных штаммов, также не превышает 60% [4]. ЛПС являются одним из главных компонентов клеточной оболочки грамотрица-тельных бактерий, биосинтез которых детерминирован посредством генов консервативной природы. Поэтому данные о строении и биохимических свойствах ЛПС могут быть использованы в качестве хемотаксономического критерия. Молекула ЛПС включает гидрофильный углеводный домен, в котором различают О-специфический
полисахарид и олигосахарид кора. Последний ко-валентно присоединяется к гидрофобной части ЛПС - липиду А, который служит связывающим звеном между углеводным доменом и внешней мембраной клетки. Молекулы ЛПС непосредственно контактируют с окружающей средой, благодаря своей локализации в наружном монослое клеточной мембраны бактерий. Эти биополимеры образуют комплексы с белковыми макромолекулами, экскретируются микробной клеткой прижизненно и после гибели клетки в окружающую среду [5]. К настоящему моменту накоплено множество данных по строению и биологическим свойствам ЛПС, выделенных из различных видов грамотрицательных бактерий. Однако ЛПС Р. fluorescens по-прежнему остаются и до настоящего времени относительно мало изученными. Используемая для многих видов грамотрицательных бактерий классификация на основе серологических свойств О-специфических полисахарид-ных цепей ЛПС для бактерий Р. fluorescens не разработана. Ранее [4, 6-12] нами изучены ЛПС штаммов, представляющих различные биовары вида Р. fluorescens, в том числе типового штамма ИМВ 4125 = АТСС 13525, представляющего биовар I и штамма ИМВ 2125, относящегося к биова-
ру III. Выяснена макромолекулярная организация, показаны особенности строения отдельных структурных частей макромолекулы ЛПС. Выявлено сходство ЛПС из различных штаммов P. fluore-scens по жирнокислотному составу и компонентам гидрофильной части липида А. По составу же коровой части и строению О-специфической полиса-харидной цепи изученные ранее ЛПС проявляли различного уровня гетерогенность.
В настоящей работе представляются результаты исследований ЛПС P. fluorescens ИМВ 2366 (биовар III). Целью работы было изолирование ЛПС и структурных частей макромолекулы и изучение особенностей состава и строения липида А, олигосахарида кора и О-специфических по-лисахаридных цепей; характеристика серологических свойств ЛПС и выяснение степени сходства ЛПС исследуемого штамма с ЛПС P. fluorescens ИМВ 2125 (биовар III), частично изученного ранее для дальнейшего использования полученных данных в систематике этих бактерий.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Штамм Pseudomonas fluorescens ИМВ 2366 (биовар III) получен из коллекции микроорганизмов, поддерживаемой в Институте микробиологии и вирусологии НАН Украины. Бактерии выращивали при 28°C на мясопептонном агаре (МПА) в течение 28 ч. Бактериальную массу смывали физиологическим раствором, суспензию центрифугировали в течении 30 мин при 6 тыс. об/мин, отмывали физиологическим раствором, сушили ацетоном и диэтиловым эфиром. О-сыворотки получали иммунизацией кроликов суспензиями убитых прогреванием микробных клеток в концентрации 4 х 109/мл, 2.5 ч, 100°C. Серологические исследования проводили по методикам, описанным в работах [6, 12]. ЛПС из сухой бактериальной массы выделяли фенол-водной экстракцией [13] при температуре 65°C, очищали трехкратным ультрацентрифугированием при 105000 g. Осадок сушили лиофильно. Для выделения фракций липида A, корового олигосахарида и О-специфи-ческого полисахарида препарат ЛПС подвергали мягкому кислотному гидролизу с 1% уксусной кислотой (1.5 ч, 100°C). Нерастворимую в воде фракцию липида A отделяли центрифугированием при 6 тыс. об/мин. Фракции, соответствующие олигосахариду кора и полисахаридной О-специфической цепи, выделяли гель-фильтрацией углеводной части ЛПС на колонке с сефадексом G-50. Метилирование жирных кислот липида A осуществляли в запаянных ампулах с 1.5 М HCl в метаноле (100°C, 3 ч), анализ метиловых эфиров жирных кислот проводили на газовом хроматографе Chrom-5 (ЧСРР) на колонке (1.2 м х 3 мм) с 5% SE-30 на Chromaton N-AW-DMCS, а также на
колонке (2 м х 3 мм) с 5% DEGS-PS на Supelcoport (100-200 меш), детектор - пламенно-ионизационный, газ носитель - гелий. Трифторацетилирова-ние метиловых эфиров оксикислот проводили, как описано в работе [11]. Полученные производные анализировали на газовом хроматографе, в условиях, приведенных выше. КДО определяли по реакции с тиобарбитуровой кислотой [14]. Общее содержание углеводов в препаратах ЛПС и содержание фосфора определяли, как в работе [7]. Нейтральные сахара в гидролизатах (2 N HCl, 4 ч, 100°C) препаратов углеводной составляющей ЛПС анализировали методом ионообменной хроматографии на колонке с анионообменной смолой ВТА 2118 ("Biotronik", ФРГ) в системе ступенчатого градиента калий-боратных буферов по методике, описанной в работе [10], а также методом ГЖХ в виде ацетатов полиолов, как описано в работе [6]. Определение абсолютной конфигурации моносахаридов проводили после их дерива-тизации в ацетилированные (Я)-2-октил гликози-ды и ГЖХ, как описано в работе [15]. XH и 13C ЯМР-спектры снимали на приборе Bruker DRX-500, в D2O при 45°C. В качестве внутреннего стандарта использовали ацетон (5н 2.225, 5с 31.45). Спектрофо-тометрический анализ препарата ЛПС проводили на спектрофотометре DU-8B ("Beckman", США).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Выделенный из сухой бактериальной массы горячим фенолом и очищенный ультрацентрифугированием препарат ЛПС P. fluorescens ИМВ 2366 (биовар III) проявлял серологическую активность в реакциях двойной иммунодиффузии в агаре и иммуноферментного анализа с гомологичной О-сывороткой, полученной иммунизацией кроликов инактивированными прогреванием бактериальными клетками, но в перекрестных реакциях с О-сыворотками к неотиповому штамму P. fluorescens ИМВ 4125 и штаммам, представляющим другие биовары вида, включая штамм ИМВ 2125 (биовар III), исследуемый ЛПС был неактивен.
При спектрофотометрическом анализе препарат ЛПС (раствор 1 мг/мл) характеризовался полосой поглощения в области 200-220 нм, примесь нуклеиновых кислот и белкового компонента была ниже детектируемого уровня. Препарат ЛПС содержал 46% углеводов при определении реакцией с фенолом и серной кислотой и 4.1% фосфора. Выход ЛПС составлял 3.4% от массы сухого ацетонового порошка бактериальной массы.
Выделенная после деградации исходного препарата ЛПС 1% уксусной кислотой при 100°С в течении 1.5 ч нерастворимая в воде фракция липида А составляла 48% массы лиофилизованного препарата ЛПС.
314
веремейченко, здоровенко
A
2 4 3
V
и
4J
10
Рис. 1. Хроматограмма разделения компонентов гид-ролизата липида A (4 N HCl, 6 ч) ЛПС P. fluorescens ИМВ 2366 (биовар III) на аминокислотном анализаторе в системе натрий-цитратных буферов: 1 - фосфоэтаноламин, 2 - аспарагин, 3 - серин, 4 - глицин, 5 -аланин, 6 - глюкозамин, 7 - гистидин, 8 - лизин, 9 -аммиак, 10
- этаноламин.
490
1.00
0.75
0.50
0.25
Уп
50
100
150
200 мл
Как основные компоненты гидрофильной части препарата липида А методом ионообменной хроматографии идентифицированы глюкозамин и фосфоэтаноламин (рис. 1). В минорных количествах присутствовали этаноламин и аминокислоты (аспарагин, серин, глицин, аланин, лейцин, глюкозамин, гистидин, лизин), часто встречающиеся в микробных мембранных белках. Количественное соотношение основных компонентов и уровень фосфорилирования (табл. 1) были такими же, как и в липиде А других
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.