ГЕНЕТИКА, 2007, том 43, № 11, с. 1468-1477
^ ОБЩАЯ ^^^^^^^^^^^^^^^^
ГЕНЕТИКА
УДК 576.315.42:576.354.422
СТРУКТУРА ХРОМАТИНА В ПРОФАЗЕ I МЕЙОЗА
© 2007 г. А. А. Строков
Институт общей генетики им. НИ. Вавилова, Москва 119991; факс: (495) 132-89-62; grishaeva@vigg.ru
Поступила в редакцию 26.09.2006 г.
Исследованы качественные и количественные изменения молекулярно-биологических структур хроматина, происходящие в профазе I мейоза. Установлены следующие закономерности: 1) процессы синтеза и интеграции в хроматин суммарного гистона и ДНК в мейотических клетках происходят, в отличие от клеток соматических, независимо и асинхронно: репликация ДНК заканчивается к интерфазе, синтез и интеграция гистона в хроматин продолжаются до поздних стадий профазы I мейоза; 2) индивидуальные фракции гистона в течение профазы мейоза синтезируются и интегрируются в хроматин независимо и асинхронно. При исследовании с использованием метода гидролиза хроматина нуклеазами ф№, STN, SI) были обнаружены весьма значительные различия продуктов гидролиза хроматина, получаемых на разных стадиях профазы I мейоза, что, видимо, отражает различия в структурах исходного хроматина, имеющиеся на разных стадиях профазы I мейоза.
Профаза I мейоза - период, в ходе которого и происходят все основные генетические процессы эукариот: синапсис и рекомбинация гомологичных хромосом, кроссинговер и т.д. Эти процессы происходят на фоне уникальной степени деком-пактизации хромосом в начале профазы и экстремальной компактизации к концу профазы - амплитуда изменения степени компактизации в мей-озе в 4 раза больше, чем в митозе [1]. Ясно, что все эти процессы должны обусловливаться (или обусловливать) кардинальными изменениями в структуре мейотического хроматина. Исследование этих структур хроматина, в частности его ги-стоновой компоненты, затруднено; так как у подавляющего числа высших организмов половые клетки находятся в смеси, цикл мейоза их мейоци-ты проходят асинхронно, а фракционировать мейоциты по стадиям профазы пока никому не удалось. Все это препятствует накоплению синхронного материала, необходимого для проведения таких исследований на строго определенных стадиях мейоза. Эти трудности удалось обойти, введя в исследования лилию Lilium candidum Ь. Этот объект обладает уникальными особенностями: все микроспороциты, содержащиеся в пыльнике определенного размера, находятся на одной и той же стадии мейоза; все бутоны одного размера содержат пыльники одного и того же размера [2], т.е. решается проблема отбора и накопления необходимых количеств синхронного материала.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве источника мейотических клеток были использованы пыльники LШum candidum Ь. Бутоны сортировали по размерам и извлекали из
них пыльники. Стадии мейоза в клетках из этих пыльников определяли цитологически. Источником соматических клеток служили чашелистики тех же бутонов. Для введения меченых аминокислот в белки бутоны с удаленными чашелистиками, пыльники которых содержали мейоциты на той или иной стадии мейоза, эксплантировали на полужидкую искусственную питательную среду [3], содержащую или [С14]-аргинин (0.080 Ки/мМ; 0.8 мкКи/мл) + [С14]-лизин (0.120 Ки/мМ; 1.2 мкКи/мл), или [С14]-аланин (0.073 Ки/мМ; 1.0 мкКи/мл). Культивировали бутоны на этой среде 22 ч и на среде с "холодными" аминокислотами 2 ч при 10-12°С. Стадии мейоза в начале и конце культивирования цитологически контролировали. Получение ядер микроспороцитов и затем хроматина из них проводили по стандартным методам с некоторыми модификациями [4]. В растворах хроматина концентрацию ДНК определяли по поглощению при А260, белка - по Лоури [5] и Бредфорду [6]. Белки (гистоны) фракционировали электрофоретически по методу Панима-Чокли [7] или по Лэмли [8] в трубках или блоках геля. Для определения той или иной фракции гистона фракционированные белки окрашивали Кумаси бриллиантовым R (количественным красителем на белок) и сканировали.
Для определения включения меченых аминокислот во фракции гистона суммарный гистон фракционировали электрофоретически; участки геля, содержащие ту или иную фракцию, вырезали, растворяли в 35%-ной перекиси водорода, этот раствор наносили на фильтр и определяли радиоактивность стандартными методами.
Гидролиз мейотического хроматина проводили стафилококковой нуклеазой ^Т^, ДНКазой I фМ) и нуклеазой Б! Гидролиз проводили на
Рис. 1. Электрофоретическое фракционирование гистонов, выделенных в разные годы (а, б) из различных типов клеток (по методу Панина-Чокли [7]). 1 - соматические клетки; 2 - митозы лилии в спорогенных клетках; 3 - средняя премейотическая интерфаза; 4 - поздняя премейотическая интерфаза; 5 - ранняя лептотена; 6 - средняя лептотена; 7 -поздняя лептотена; 8 - лептотена-зиготена; 9 - зиготена; 10 - зиготена-пахитена; 11 - зиготена-пахитена; 12 - деления мейоза.
а б
ftiîaîi.
Фндени ||;и
1 23 45 67 89 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7
изолированных ядрах в стандартных условиях 20 или 60 мин. Полученный гидролизат центрифугировали 20 мин при 5800 g. Полученный суперна-тант использовали как тотальный гидролизат (ТГ), определяли концентрацию ДНК и белка. Осадок обозначали как негидролизованный хроматин (PI - 20 мин, PII - 60 мин). На некоторых стадиях к ТГ приливали НС1О4 до 5% и центрифугировали 20 мин при 25 000 g, в супернатанте остаются фрагменты ДНК около 10-12 пн - кислото-растворимая фракция ДНК (КРФ). Долю кислото-нерастворимой фракции ДНК (КНРФ) вычисляли как ТГ-КРФ. Гидролизованный хроматин ТГ фракционировали в системе ДНП-электрофоре-за в буфере низкой ионной силы [9] и окрашивали бромистым этидием (ДНК). Белковую компоненту ТГ анализировали при двумерном электрофорезе. Для этого гели с фракционированным ТГ вымачивали в 1%-ном SDS-Na, помещали на поверхность блока геля второго направления, заливали расплавленной агарозой и проводили электрофорез по системе Лэмли. Белки PI и PII разделяли в той же системе Лэмли.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Обнаружение гистона мейоза (НМ)
Одно из первых отличий молекулярной структуры хроматина мейотических клеток от структуры хроматина соматических клеток было обнаружено Шериданом и Стерном [2] и подтверждено нами [4] - это факт появления в мейотическом хроматине дополнительной фракции гистона, названной FM, или НМ (рис. 1). Этот факт много позднее был подтвержден и рядом других авторов.
Задержка синтеза и интегрирования тотального гистона
Ю.Ф. Богдановым и Е.Н. Антроповой [10] цитохимическими методами было обнаружено, что в профазу первого мейоза мейоциты входят с недостаточностью по гистону и эта недостаточность ликвидируется лишь к концу профазы, т.е. отношение гистон/ДНК не равно 1, как в соматических клетках, а меньше. Но эта работа была выполнена цитохимическими методами и требовалось подтверждение ее результатов на молеку-лярно-биологическом уровне. Результаты таких исследований приведены на рис. 2 и они подтверждают факт вхождения мейотических клеток с несбалансированным по количественным показателям основных компонентов хроматином (гистон/ДНК < 1). Также было показано, что баланс достигается (гистон/ДНК = 1) лишь к лептотене-зиготене. Процесс профазного аккумулирования гистона на этом не прекращается и к концу профазы I баланс вновь нарушается, но уже в обратную сторону (гистон/ДНК > 1).
Аккумулирование индивидуальных фракций в профазе I
Для понимания природы задержанного до конца профазы I мейоза процесса аккумулирования тотального гистона исследовали кинетику аккумулирования индивидуальных фракций гистона в этот период. Гистон, выделенный из клеток на разных стадиях мейоза, фракционировали элек-трофоретически и гели с фракционированным гистоном, окрашенным количественным красителем, денситометрировали, чтобы определить относительное содержание каждой индивидуальной фракции гистона на каждой стадии профазы I мейоза (результаты не представлены). Несмотря
ПИПЛ РЗПЗ СП ДП
Рис. 2. Синтез и аккумулирование суммарного гистона и аккумулирование ДНК в профазе I мейоза у лилии. (О-О) - динамика изменения содержания ДНК в ед. плоидности (С); (+-+) - включение меченых аминокислот в суммарный гистон (в %); (х-х) - динамика изменения содержания суммарного гистона в ед. плоидности [С]. По оси абсцисс: СМ - соматические клетки, СИ - средняя интерфаза, ПИ - поздняя интерфаза, ПЛ - поздняя лептотена, ЛЗ - лептотена-зиготена, РЗ - ранняя зиготена, ПЗ - поздняя зиготе-на, ЗП - зиготена-пахитена, СП - средняя пахитена, ДП - диплотена, Щ - I деление мейоза; по оси ординат: слева - ед. плоидности [С], справа - отношение включения меченых аминокислот в гистон (имп/мг гистона за 1 мин) к молярному содержанию этих аминокислот.
на относительно слабую выраженность волн аккумулированных фракций, из приведенных результатов можно сделать вывод, что в профазе I мейоза индивидуальные фракции гистона интегрируются в хроматин по отдельности, асинхронно.
Синтез фракций гистонов
Таким образом: а) в профазу I мейоза хромосомы вступают несбалансированными по содержанию двух основных компонент хроматина, ДНК и гистона, со значительной недостаточностью по гистоновой компоненте, и этот дисбаланс ликвидируется лишь к концу профазы I; б) этот процесс проходит асинхронно - фракции гистона аккумулируются в хроматин в разные сроки, индивидуально. Для проверки и подтверждения этих данных были проведены эксперименты по кинетике включения меченых аминокислот в тотальный гистон и в индивидуальные фракции гистона в профазе I мейоза, т.е. по их синтезу. Результаты по кинетике задержанного синтеза тотального гистона представлены на рис. 2. Синтез тотально-
го гистона происходит двумя пиками: ранним (средняя интерфаза-зиготена-пахитена) и поздним (зиготена-пахитена-диплотена). На рис. 3 представлены результаты исследований синтеза фракций гистона в профазе I, показавшие, что этот синтез, а следовательно, и интеграция (аккумулирование) фракций в этот период асинхронны. Фракции НМ, Н3, Н4 являются раннесинтези-руемыми (ранний пик синтеза тотального гистона), позднесинтезируемая фракция Н2а + Н2Ь синтезируется, возможно ввиду своей суммарной двойственности, двумя пиками.
Сумма резу
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.