ш
УДК 577.352.24
СТРУКТУРА И СТАБИЛЬНОСТЬ АНИОННЫХ ЛИПОСОМ В КОМПЛЕКСЕ С СОПОЛИМЕРОМ PEG-ХИТОЗАН
© 2014 г. И. М. Дейген, Е. В. Кудряшова#
Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва Поступила в редакцию 07.11.2013 г. Принята к печати 05.05.2014 г.
Продемонстрировано, что использование разветвленных сополимеров на основе хитозана, модифицированного полиэтиленгликолем (РЕО-хитозан), в качестве стабилизирующих добавок для анионных липосом, позволяет многократно увеличить их стабильность при хранении. Разработан эффективный и удобный с методической точки зрения способ синтеза сополимеров РЕО-хитозан путем химической модификации аминогрупп хитозана монометокси-РЕО-Ж-гидроксисукцинимидилсукцинатом (тРЕО^ис-МНЗ). Получены препараты хитозана с различными степенями пэгилирования, которые были использованы в качестве стабилизирующих добавок для анионных липосом состава дипальмито-илфосфатидилхолин/кардиолипин (80/20 по весу). Молекулярный механизм образования комплексов анионных липосом с хитозаном и сополимерами (РЕО-хитозанами) изучен методами ИК-спектроско-пии Фурье и динамического светорассеяния. В липосомах определены основные сайты связывания с аминополисахаридами: фосфатная и карбонильная группы. Показано, что наибольший вклад в стабилизацию структуры комплексов вносят электростатические взаимодействия анионных групп кардиоли-пина и свободных аминогрупп РЕО-хитозана. Разработанный способ получения стабилизированных липосом является перспективным для создания новых систем доставки лекарственных средств.
Ключевые слова: анионныелипосомы, ИК-спектроскопия, динамическое светорассеяние, РЕО-хитозан, разветвленные сополимеры, стабилизация.
БО1: 10.7868/80132342314050054
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время липосомы привлекают исследователей как модельные системы для изучения механизмов функционирования биомембран, а также в качестве перспективных средств доставки биоактивных молекул и лекарственных средств [1— 4]. Ряд липосомальных препаратов, в том числе препараты для онкотерапии на основе доксорубицина, цисплатина и др., достигли стадии клинических испытаний; некоторые из них лицензированы и применяются в медицинской практике [5]. Однако короткое время циркуляции липосом в кровотоке, низкая стабильность и склонность к агрегации ограничивают применимость липосомальных форм [3, 4]. Поэтому большое внимание исследователей в настоящее время уделяется разработке стабилизированных липосом с использованием добавок на основе полимерных материалов. Наибольшее распространение получил метод включения в липосо-мы РЕО-модифицированных липидов. Так, в медицинской практике применяются стабилизирован-
Сокращения: CL — кардиолипин; DLS — динамическое светорассеяние; DPPC — дипальмитоилфосфатидилхолин; FTIR — ИК-спектроскопия Фурье; mPEG-suc-NHS — моно-метокси-РЕО-Лг-щдроксисукцинимидилсукцинат; PEG — полиэтиленгликоль; TNBS — тринитробензолсульфокис-лота.
# Автор для связи (эл. почта: Helena_koudriachova@hotmail.com).
ные липосомальные препараты, например ЭохЛ®, Муосй®, СаеЦх® [5]. Однако проблема создания эффективных лекарственных форм пролонгированного действия, в том числе на основе липосом, по ряду параметров все еще далека от оптимального решения и требует дальнейших исследований.
Представленное исследование посвящено разработке нового подхода к получению стабилизированных липосом, который основан на образовании комплексов анионных липосом с привитыми сополимерами "щеточной" структуры на основе хитозана, модифицированного полиэтиленгли-колем. Хитозан — биосовместимый и биодегради-руемый поликатионный полисахарид, который широко применяется в косметической и фармацевтической промышленности в качестве носителя лекарственных средств [6—13]. Физико-химические свойства сополимеров хитозана можно целенаправленно варьировать в широком диапазоне за счет варьирования молекулярной массы полисахарида, степени дезацилирования его аминогрупп [14, 15]. Наличие аминогрупп, в свою очередь, обусловливает широкие возможности для проведения реакций химической модификации хитозана [15—19]. Пэгилирование хитозана повышает его растворимость [20], а также открывает возможность получать сополимеры разветвленного строения с регулируемыми свойствами за счет варьирования состава сополимера [21].
Применение сополимеров РЕО-хитозан представляется перспективным решением для создания стабилизированных липосом. Важным преимуществом использования подхода хитопэгилирования для получения стабилизированных липосомаль-ных препаратов по сравнению с традиционным включением в состав липосом РЕО-модифициро-ванных липидов является полиэлектролитная природа сополимеров, которая обусловливает возможность целенаправленно изменять условия существования комплекса (ионную силу, рН) а также знак и плотность заряда вблизи поверхности липо-сом, снижает тенденцию к агрегации за счет электростатического отталкивания заряженных частиц. Кроме того, многоточечное электростатическое взаимодействие РЕО-хитозана с анионными липо-сомами способствует стабилизации структуры липосом. Оптимизация свойств сополимера позволяет добиться не только значительной стабилизации липосом и увеличения срока хранения липосо-мальных препаратов, но также снижает иммуно-генность за счет экранирования их поверхности разветвленным сополимером.
Для исследования структурных характеристик данных надмолекулярных систем на основе липосом в комплексе с РБО-хитозаном была применена ИК-спектроскопия Фурье. Данный метод является высокоинформативным и удобным при исследовании липосомальных систем; гетерогенность и оптическая непрозрачность системы не препятствуют проведению анализа. Метод позволяет следить за изменениями в структуре липосом и состоянии их основных функциональных групп, в
том числе при фазовом переходе и взаимодействии с лигандами [22—26]. Нами показано, что анализ ИК-спектров позволяет получать детальную информацию о структуре комплекса липосом с PEG-хитозаном, исследовать влияние полимера на молекулярное состояние бислоя и роль каждой из функциональных групп липидных молекул в комплексообразовании; определять сайты связывания лиганда с бислоем.
Целью представленной работы является исследование молекулярных деталей комплексооб-разования липосом с разветвленными сополимерами PEG-хитозан, а также получение стабилизированных анионных липосом с использованием данных сополимеров.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Получение и характеристика сополимеров PEG-хитозан
Для получения стабилизированных липосом в представленной работе предложен новый подход, основанный на использовании разветвленных сополимеров на основе хитозана, модифицированного полиэтиленгликолем (PEG-хитозан). Был проведен синтез сополимеров хитозана (М 90—100 кДа) с активированным производным PEG, мономе-токси-PEG-^-гидроксисукцинимидилсукцина-том (mPEG-suc-NHS, М 5 кДа), которое отличается высокой реакционной способностью и в мягких условиях ацилирует аминогруппы биомолекул с высоким выходом [27] (схема).
HO HQ-
OH
пн
nh2
h,c
O
HO
O
NH2
HO
O
OH
\HO
NH2
Схема. Схема синтеза сополимеров PEG-хитозан с использованием активированного производного PEG (mPEG-suc-NHS).
Преимущества предложенной методики синтеза по сравнению с уже известными [21, 28, 29] — мягкие условия проведения реакции за счет высокой реакционной способности mPEG-suc-NHS и возможность получать сополимеры с широким диапазоном степеней модификации. Следует отметить также методическую простоту получения сополимера без необходимости проведения предварительных стадий и/или длительного синтеза.
Следует ожидать, что свойства сополимеров PEG-хитозан будут существенным образом зависеть от их состава и структуры. Так, при повышении содержания PEG-цепей в сополимере, с одной стороны, повышается растворимость продукта, а с другой стороны — уменьшается число свободных аминогрупп хитозана, доступных для электростатического взаимодействия с фосфолипидами липосом. Для выбора сополимера с оптимальным стабилизирующими свойствами в отношении липосом, мы синтезировали образцы PEG-хитозана с различным содержанием PEG-цепей.
Для характеристики полученных сополимеров использовали ИК-спектроскопию Фурье (FTIR). Метод позволяет определять содержание характеристических функциональных групп в структуре изучаемых молекул и, соответственно, степень модификации биополимеров.
Для хитозана и его модифицированного производного (PEG-хитозана) наблюдается ряд общих полос поглощения, относящихся к функциональным группам хитозана (рис. 1). Полосы поглощения в области 3000—2900 см-1 соответствуют валентным колебаниям связей С-H метиленовых групп. Наличие свободных аминогрупп в структуре хитозана приводит к появлению полосы в области 1600-1540 см-1, которая соответствует асимметричным деформационным колебаниям
аминогрупп -N H+, и полосы при 1317 см-1, которая отвечает симметричным деформационным колебаниям аминогрупп. Полосы поглощения в области 1430-1370 см-1 обусловлены деформационными колебаниями -СН2- и -ОН-групп. Кроме вышеописанных максимумов, в ИК-спектрах хитозана присутствует набор низкоинтенсивных полос поглощения в интервале частот 1200-950 см-1, принадлежащих к колебаниям С-О-С-, С-N- и С-С-связей в молекуле аминополисахарида [13].
Из анализа ИК-спектра PEG-хитозана (рис. 1) следует, что в результате модификации хитозана активированным производным PEG (mPEG-suc-NHS) (схема) наблюдается появление высокоинтенсивной полосы поглощения при 1089 см-1, которая соответствует валентным колебаниям С-О-С-связи и является основной характеристической полосой поглощения молекулы PEG. Следует отметить, что полоса поглощения хитозана в области 1200-950 см-1 существенно менее
А, ОЕ
V, см 1
Рис. 1. ИК-спектры PEG-хитозана (2) в сравнении с немодифицированным хитозаном (1) при одинаковых концентрациях хитозана (1 мг/мл) в 5 мМ натрий-фосфатном буфере, рН 7.0; 22°C.
интенсивна по сравнению с полосой поглощения С-О-С-связи в PEG и вносит лишь незначительный вклад в общую интенсивность поглощения при 1089 см-1 в PEG-хитозане. Наблюдаемое увеличение интенсивности данной полосы в спект
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.