ЭКОЛОГИЯ, 2007, № 3, с. 163-171
УДК 575.174.015.3+582.475
СТРУКТУРА ИЗМЕНЧИВОСТИ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК И ПОСЛЕЛЕДНИКОВАЯ ИСТОРИЯ ЛИСТВЕННИЦЫ СИБИРСКОЙ
(Larix sibirica Ledeb.)
© 2007 г. В. Л. Семериков*, А. И. Ирошников**, М. Ласко***
*Институт экологии растений и животных УрО РАН 620144 Екатеринбург, ул. 8 Марта, 202 E-mail: semerikov@ipae.uran.ru **Научно-исследовательский институт лесной генетики и селекции 394087 Воронеж, ул. Ломоносова, 105 E-mail: ilgis@lesgen.vrn.ru ***Университет г. Уппсала 752 36 Uppsala, Sweden, Norbyvagen, 18D E-mail: Martin.Lascoux@ebc.uu.se Поступила в редакцию 15.11.2005 г.
Изучена изменчивость митохондриальной ДНК в популяциях лиственницы сибирской с помощью пяти основанных на ПЦР маркеров, характеризующих 29 гаплотипов. Исследованные популяции, представляющие основные части ареала, образуют несколько географически обособленных групп, имеющих специфические наборы гаплотипов и, вероятно, соответствующих по происхождению отдельным рефугиумам лесной растительности последнего ледникового максимума. Делаются выводы о возможном расположении этих рефугиумов, путях и характере послеледниковой реколониза-ции современного ареала лиственницы сибирской. Пространственное распределение гаплотипов в пределах отдельной популяции носит неслучайный характер. Типичный размер территории, занимаемой группой особей, имеющих одноименный гаплотип, составляет в поперечнике 50-100 м.
Ключевые слова: лиственница сибирская, филогеография, митохондриальная ДНК, ледниковые ре-фугиумы, Северная Евразия, плейстоцен, голоцен.
Современное распределение таежной растительности в Северной Евразии есть результат послеледникового расселения лесных видов, сохранявшихся в ходе последнего ледникового максимума (20-18 тыс. л. н.) в отдельных рефугиумах. Длительная изоляция видов в виде небольших популяций ледниковых рефугиумов и последующее расселение оставили определенные следы в характере и географической структуре генетической изменчивости видов живых организмов (Hewitt, 1996), изучение которых дает дополнительную информацию об истории популяций соответствующих видов, о климатах и ландшафтах прошлого.
Ранее проведенные исследования генетической изменчивости лиственницы сибирской на основе аллозимных маркеров, хлоропластных микросателлитов, AFLP и маркеров митохондриальной ДНК (Semerikov et al., 1999; Semerikov, Lascoux, 2003) подтвердили вывод Н.В. Дылиса (1947) о существовании внутри этого вида двух генетически различных рас - восточной, собственно Larix sibirica, и западной, названной им L. sukaczewii Dylis. Первая из них обитает в Восточной Сибири и восточной части Западной Сибири, Монголии, Восточном Казахстане, на севе-
ро-западе Китая (Восточный Тянь-Шань), вторая -в европейской части России, на Урале и в западной части Западной Сибири, примерно к западу от Оби и Иртыша (рис. 1). Хотя за западной расой сибирской лиственницы и закрепилось название L. sukaczewii, однако необходимо заметить, что в соответствии с правилами ботанической номенклатуры приоритетным для нее является название L. archangelica Laws. (Цвелев, 1994). По алло-зимным маркерам, AFLP и хлоропластным микросателлитам оба таксона имеют сходный уровень изменчивости. В то же время эти таксоны резко различаются по митохондриальной ДНК: восточная раса имеет несколько митохон-дриальных гаплотипов, а западная раса содержит два гаплотипа, один из которых очень редок. Гап-лотипы западной расы филогенетически родственны некоторым гаплотипам восточной, что указывает на происхождение западной расы от восточной, а также на малый эффективный размер популяции (Ne) у первого при сравнительно большом Ne у второго. По нашему мнению, генетические различия между этими таксонами не превышают величин, характерных для межпопу-ляционных различий внутри видов. Поэтому мы считаем целесообразным рассматривать запад-
Щ
я
о а о ч
к
2 о о о
Рис. 1. Ареалы видов лиственниц в Северной Евразии и расположение проанализированных популяций.
Заштрихована предполагаемая зона интрогрессивной гибридизации (Ь. sibirica х Ь. gmelinii) и зона контакта западной и восточной рас Ь. sibirica; пунктирными линиями очерчены географические группы популяций, для которых вычислены средние частоты гаплотипов, обозначенные в круговых диаграммах; прямоугольником обозначен район, представленный на рис. 2.
ную и восточную расы L. sibirica в ранге подвидов или географических рас.
Географическая приуроченность западной расы L. sibirica к Уралу и восточной - к Восточной Сибири свидетельствует о наличии ледниковых рефугиумов лесной растительности как в Сибири, так и на Урале.
В настоящей работе мы анализировали изменчивость митохондриальной ДНК лиственницы сибирской - одного из основных лесообразовате-лей тайги Сибири, Урала и северо-востока Европы - в целях изучения истории бореальной растительности Евразии в позднем плейстоцене и голоцене. Мы значительно увеличили количество проанализированных популяций по сравнению с предыдущим исследованием и использовали маркеры митохондриальной ДНК, основанные на ПЦР и позволяющие отказаться от использования трудозатратного и дорогостоящего метода Саузерн-блот. Выбор митохондриальных маркеров был обусловлен их более высокой эффективностью в сравнении с хлоропластными и ядерными маркерами (Burban, Petit, 2003), главным образом благодаря материнскому характеру наследования митохондрий у хвойных и ограниченной подвижности семян по сравнению с пыльцой (Palmer, 1992).
В данной работе решались следующие вопросы:
1. Уточнение районов расположения основных ледниковых рефугиумов лиственницы сибирской и путей ее расселения в послеледниковое время.
2. Уточнение зоны контакта восточной и западной рас сибирской лиственницы.
3. Изучение характера распределения митохондриальных гаплотипов в пределах отдельных насаждений лиственницы сибирской.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Выборки из 3-30 растений были проанализированы в 99 популяциях лиственницы сибирской и гибридов лиственниц сибирской и даурской (L. gmelinii Rupr.), а для сравнения - в двух популяциях лиственницы европейской (L. decidua Mill.) (см. рис. 1). Материал взят из нескольких источников: из коллекций, использованных ранее (Se-merikov, Lascoux, 2003), из географических культур Воронежского лесотехнического университета (Дерюжкин, 1970), из географических культур стационара "Погорельский Бор" Института леса СО РАН (Ирошников, 1977), а также из сборов в природных популяциях. Названия, координаты, параметры генетической изменчивости и частоты гаплотипов в изученных популяциях могут быть предоставлены читателю первым автором по электронной почте.
ДНК была выделена из хвои, замороженной в жидком азоте и хранившейся при -80°C, или из
хвои, высушенной в силикагеле, или из одномесячных сеянцев с помощью метода CTAB (Devey et al., 1996). Нами использовано пять маркеров (изменчивых фрагментов митохондриальной ДНК, амплифицированных с помощью специфичных ПЦР праймеров): nad5(1-2), nad4(3-4) (Dumolin-Lapegue et al., 1997), UBC460, R11 и C8 (Semerikov et al., 2006). Амплификацию проводили с помощью ПЦР машины GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems) в 10 |l реакционной смеси, содержащей однократный ПЦР буфер (75 mM Трис-HCl (pH 8.8 при 25°C), 20 mM (NH4)2SO4, 0.1% Твин 20), 2.5 mM MgCl2, 200 |M каждого dNTP, 0.2 |M прямого и 0.2 |M обратного праймера, 0.5 единицы Taq ДНК полимеразы (производство MBI Fermentas или Сибэнзим) и 10 нг геномной ДНК. Температурный профиль ПЦР состоял из первоначальной денатурации при 94°C в течение 5 мин и 35 циклов амплификации. Каждый цикл включал денатурацию при 94°C в течение 30 с, отжиг при 65°C - для фрагмента UBC460, 57°C - для фрагмента nad5(1-2) и 55°C -для остальных фрагментов в течение 45 с и элонгацию при 72°C в течение 1.5 мин для фрагмента C8, 2 мин - для фрагментов nad5(1-2), nad4(3-4) и R112, и 3 мин - для UBC460. Процесс завершала финальная элонгация при 72°C в течение 10 мин.
Делеции, инсерции, мутации числа повторов в минисателлите и мутации сайтов рестрикции фиксировали в фрагментах nad5(1-2), nad4(3-4) и R11 после рестрикции ферментом Hinfl и электрофореза в сиквенсном денатурирующем поли-акриламидном геле с последующим серебряным окрашиванием. Полиморфизм, обусловленный наличием или отсутствием ПЦР продукта фрагмента C8, и изменчивость длины фрагмента UBC460 анализировали с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном геле.
Стандартные параметры внутрипопуляционо-го разнообразия были вычислены с помощью программы Arlequin 2.000 (Shneider et al., 2000). Анализ подразделенности генетической изменчивости проводили с использованием двух статистик: GST и RST. Первую вычисляли на основе частот гаплотипов в популяциях без учета информации о степени сходства между гаплотипами, RST, аналог GST, - на основе частот гаплотипов и величин сходства между ними. В качестве меры сходства между двумя гаплотипами использовали квадрат разницы в числе повторов минисателли-та, содержащегося в фрагменте R11. Для анализа отбирали только те особи, которые имели не "нуль-аллель" по локусу R11, т.е. давали соответствующий ПЦР продукт. Вычисляли и сравнивали указанные параметры посредством алгоритма O. Pons и R. Petit (1996) и программы CPSSR (http://www.pierroton.inra.fr/genetics/labo/Software/).
Если RST > GST, то разные, но филогенетически
Описание гаплотипов в митохондриальных локусах
Локус
Гаплотип nad5(1-2r)*/HinfI nad4(3c-4r*)/Hin/I UBC460** Я11*, присутствие/отсутствие ПЦР продукта или число повторов минисателлита C8*, присутствие/отсутствие ПЦР продукта (-/+)
D Инсерция 4bp 2300bp - -
G 200bp —► 80bp + + 120bp, мутация сайта рестрикции 2300bp
S0 2300bp - -
S1 2300bp - +
LN 2788bp - +/-
L0-L24 2788bp число повторов минисателлита 0-24 +/-
* Dumolin-Lapegue et al., 1997. ** Semerikov et al., 2006.
близкие гаплотипы имеют тенденцию сосуществовать совместно.
Кроме того, для всех изученных популяций сибирской лиственницы вычислялся параметр FST (идентичный GST) с помощью анализа молекулярной вариации AMOVA (Weir, Cockerham, 1984), без учета различий между гаплотипами. Его
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.