научная статья по теме СТРУКТУРА КОМПЛЕКСА УРИДИНИФОСФОРИЛАЗЫ ИЗ YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS С МОДИФИЦИРОВАННЫМ БАКТЕРИОСТАТИЧЕСКИМ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ ПРЕПАРАТОМ ПО РЕЗУЛЬТАТАМ ИССЛЕДОВАНИЯ МЕТОДАМИ РЕНТГЕНОСТРУКТУРНОГО АНАЛИЗА И КОМПЬЮТЕРНОГО ЭКСПЕРИМЕНТА Химия

Текст научной статьи на тему «СТРУКТУРА КОМПЛЕКСА УРИДИНИФОСФОРИЛАЗЫ ИЗ YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS С МОДИФИЦИРОВАННЫМ БАКТЕРИОСТАТИЧЕСКИМ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ ПРЕПАРАТОМ ПО РЕЗУЛЬТАТАМ ИССЛЕДОВАНИЯ МЕТОДАМИ РЕНТГЕНОСТРУКТУРНОГО АНАЛИЗА И КОМПЬЮТЕРНОГО ЭКСПЕРИМЕНТА»

КРИСТАЛЛОГРАФИЯ, 2015, том 60, № 2, с. 240-249

^ СТРУКТУРА МАКРОМОЛЕКУЛЯРНЫХ

СОЕДИНЕНИЙ

УДК 544.1+548.737+577.1+577.3

СТРУКТУРА КОМПЛЕКСА УРИДИНИФОСФОРИЛАЗЫ ИЗ Yersinia pseudotuberculosis С МОДИФИЦИРОВАННЫМ БАКТЕРИОСТАТИЧЕСКИМ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ ПРЕПАРАТОМ ПО РЕЗУЛЬТАТАМ ИССЛЕДОВАНИЯ МЕТОДАМИ РЕНТГЕНОСТРУКТУРНОГО АНАЛИЗА И КОМПЬЮТЕРНОГО

ЭКСПЕРИМЕНТА

© 2015 г. В. В. Балаев, А. А. Лашков, А. Г. Габдулхаков, Т. А. Серёгина, М. В. Донцова, А. М. Михайлов

Институт кристаллографии РАН, Москва E-mail: alashkov83@gmail.com Поступила в редакцию 10.09.2014 г.

Псевдотуберкулез и бубонная чума — острые инфекционные заболевания, вызываемые бактериями Yersinia pseudotuberculosis и Yersinia pestis. Одним из препаратов для лечения указанных заболеваний является триметоприм и его модифицированные формы. Однако имеющиеся в бактериальных клетках уридинфосфорилазы (пиримидинфосфорилазы) нейтрализуют действие триметоприма и его модифицированных форм на клетки. Для установления характера взаимодействия лекарственного препарата с бактериальной уридинфосфорилазой методом рентгеноструктурного анализа решена атомная структура нелигандированной молекулы уридинспецифичной пиримидинфосфорилазы Yersinia pseudotuberculosis (YptUPh) при разрешении 1.7 А с высокой достоверностью (Rwork = 16.2; Rfree = 19.4%; r.m.s.d. длин связей 0.006 А и углов 1.005°; DPI = 0.107 А). Локализованы атомы аминокислотных остатков функционально важных элементов вторичной структуры фермента Yp-tUPh петли L9 и спирали H8. Методом компьютерного моделирования определена трехмерная структура комплекса YptUPh с модифицированной формой триметоприма — 53I. Показано, что 53I является псевдосубстратом уридинфосфорилаз, а его пиримидиндиаминовая группа локализуется в фосфатсвязывающем сайте энзима YptUPh.

DOI: 10.7868/S0023476115020034

ВВЕДЕНИЕ

Yersinia pseudotuberculosis (YptUPh) — бактерия, относящаяся к семейству Enterobacteriaceae, роду Yersinia, является возбудителем псевдотуберкулеза. Инфекционное заболевание преимущественно поражает желудочно-кишечный тракт, опорно-двигательный аппарат, кожу [1—3]. В [4] показано, что YptUPh является эволюционным предшественником Yersinia pestis, вызывающей бубонную чуму, и основные метаболические пути в них одинаковы.

Бактериостатический антибиотик триметоприм (TOP, по номенклатуре PDB) [PubChem CID 5578] является ингибитором бактериальной дигидрофолатредуктазы и используется при лечении заболеваний как псевдотуберкулеза, так и бубонной чумы [5, 6]. В [5, 6] показано, что в бактериях рода Yersinia пиримидинфосфорилазы (ти-мидин- и уридин-фосфорилазы) выполняют, в

том числе, защитную функцию от бактериостати-ческого действия триметоприма.

В [7] синтезирован аналог триметоприма {(2Е)-3-{5-[(2,4-диаминопиримидин-5-ил)ме-тил]-2,3-диметоксифенил}-1-[(Ы)-1- (2-метил-проп-1-ен-1-ил)фталазин-2(1#)-ил]проп-2-ен-1 -он, имеющий более высокую константу инги-бирования фермента-мишени дигидрофолатредуктазы по сравнению с ТОР [7].

Для установления характера взаимодействия молекулы модифицированного триметоприма (53I, по номенклатуре PDB) с YptUPh необходимо прежде всего определить трехмерную структуру этого биомакромолекулярного комплекса и провести сравнение пространственных структур комплексов YptUPh + 53I и ранее изученного YptUPh + TOP [8].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клонирование гена уридинфосфорилазы Yersinia pseudotuberculosis. В качестве матрицы для клонирования гена уридинфосфорилазы (udp) использовали геномную ДНК Y. Pseudotuberculosis. ПЦР-амплификацию фрагмента проводили с участием специфических праймеров Y01 (5'-GGGGAAT-TCGTTGGCGCGATTCATGCCTCGG-3') и Y02 (5'-GCGGGAT££GGATTACAGCAGATGAC-GAGCGG-3'), содержащих сайты узнавания для рестриктаз EcoRI и BamHI соответственно (подчеркнут полученный в результате ПЦР-ампли-фикации фрагмент размером 1007 пар оснований, содержащий полноразмерный ген udp, обрабатывали рестриктазами EcoRI и BamHI (Sigma-Al-drich, St. Louis, MO, USA, http://www.sigmaal-drich.com) и далее клонировали в вектор pUC19, обработанный теми же рестриктазами. После ли-гирования плазмиду трансформировали в культуру клеток E. coli штамма AM2009 с генотипом (F- thi1 thr1 leuB6 lacY1 tonA21 supE44 A(lac-proAB) A(metE-udp)). Штамм культивировали на минимальной среде с ампициллином (100 мкг/мл) и уридином (0.2%) в качестве единственного источника углерода с целью отбора трансформантов, экспрессирующих ген udp [9]. В итоге получили плазмиду pMZ18, несущую ген udp из Y. pseudotu-berculosis.

Выделение и очистка белка уридинфосфорилазы YYptUPh. Отобранные клетки штамма E. coli AM2009, содержащие плазмиду pMZ18, выращивали в течение 16 ч на полноценной среде Луриа [10] с ампициллином (100 мкг/мл) при 37°С. Клетки осаждали центрифугированием (10000 об/мин, 10 мин) и ресуспендировали в 50 мМ трис-HCl-

(а)

Рис. 1. Фотография SDS-электрофореграммы YptUPh (а), полученной на первом этапе гельфильтрации на колонке с наполнителем бутил-сефароза (II), на втором этапе гельфильтрации на колонке с наполнителем Q-сефароза (III). В качестве маркерного белка использована уридинфосфорилаза VchUPh (I), с молекулярной массой 27.5 кДа. Фотография кристаллов уридинфосфорилазы из Yersinia pseudotuberculosis (б).

буфере при pH 6.8, содержащем 5 мМ меркапто-этанола, 0.3 мМ фенилметансульфонил фтора (PMSF) и 5% глицерина. Разрушение клеток проводили ультразвуком, с использованием дезинте-гратора-550 (Fisher Scientific, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA). В биомассу центрифугирования (13000 об/мин, 10 мин) к надосадочной жидкости добавляли 10% (о/о) раствор полиэти-ленимина (Polymin P) при pH 6.0 и инкубировали с перемешиванием в течение 12 ч при 30°С [9].

Осветленную центрифугированием (13 000 об/мин, 10 мин) белковую фракцию ресуспендировали в 50 мМ трис^а-буфер pH 7.5, содержащий 2 М сульфата аммония, 5 мМ меркаптоэтанола, 0.3 мМ PMSF, и инкубировали 12 ч. Полученный осадок концентрировали при небольших оборотах, ре-суспендировали в 50 мМ трис^О-буфер при pH 7.5, содержащий 2 М сульфата аммония, и очищали методом гельфильтрации на колонке с наполнителем бутил-сефарозой (Amersham Pharmacia Biotech), уравновешенным тем же буфером. Белок элюировали градиентом сульфата аммония (от 2 до 0 М) со скоростью протока 0.5 мл/мин. Отобранные фракции анализировали с помощью электрофореза в денатурирующих условиях (рис. 1а) на полиакриламидном геле SDS—PAGE [11, 12]. На втором этапе очистки энзима YptUPh в качестве носителя использовали Q-сефарозу (Amersham Pharmacia Biotech), уравновешенную 50 мМ трис^О-буфера pH 7.5, содержащего 20 мМ хлорида натрия. С колонки с Q-сефарозой белок элюировали с использованием градиента NaCl (от 20 мМ до 1 М) со скоростью протока 1 мл/мин. Отобранные фракции диализовали против 20 мМ трис^О-буфера при pH 7.5, содержащего 20 мМ хлорида натрия, и концентрировали до ~15 мг/мл в том же буфере. Концентрацию белка определяли по методу Бредфорда [13] с использованием набора химических реактивов для исследований оптической плотности (BioRad Laboratories, Hercules, USA).

Чистоту и молекулярную массу субъединицы upd определяли методом SDS-электрофореза в 10%-ном полиакриламидном геле (ПААГ). Маркерным белком служила upd из Vibrio cholerae, молекулярная масса субъединицы которой равна 27.5 кДа.

Кристаллизация нелигандированной YptUPh. Выращивание кристаллов фермента, пригодных для рентгеноструктурного анализа, проведено методом диффузии в парах в варианте "сидячей капли" при комнатной температуре. Противорас-твор объемом 500 мкл составлен из 0.1 М трис-HCl при pH 7.8, 5% (м/о) ПГК (полиглютамино-вая кислота) и 20% (м/о) ПЭГ (полиэтиленгли-коль) 2000. Кристаллизационный раствор составлен из 5 мкл YptUPh с концентрацией 10 мг/мл в 10 мМ трис^О-буфере при pH 6.5 и 5 мкл про-

Таблица 1. Параметры сбора данных и характеристики набора экспериментальных интенсивностей

Пространственная группа H3 (№ 146)

Параметры элементар- a = b = 150.74, с = 46.31,

ной ячейки, А, град Y = 120.0

Температура, К 110

Длина волны,А 1.542

Источник излучения X8 PROTEUM, Bruker-AXS

MicroStar (рентгеновская

трубка с вращающимся

анодом)

Детектор CCD (BRUKER

PLATINUM 135)

Расстояние кристалл— 50

детектор, мм

Диапазон разрешения, А 75.4-1.70 (1.80-1.70)*

Среднее значение (1/о(1)) 9.29 (1.64)*

(%) 5.78 (2.74)*

Повторяемость 1.89 (1.55)*

Полное число отражений 121480 (18490)*

Число независимых 42114 (6503)*

отражений

Полнота набора, % 99.0 (95.6)*

Число димеров на незави- 1

симую часть элементар-

ной ячейки

Число аминокислотных 253

остатков на субъединицу

Молекулярная масса 27.5

субъединицы, кДа

Коэффициент Метьюза 1.87

[30], А3/Да

Содержание раствори- 34.10

теля, %

Программное обеспечение PROTEUM2

http://www.bruker. com/)

* В скобках приведены значения для последней зоны высокого разрешения.

+Rmerge = \Щк1) — {I(hkl))\/ZhklZ¡\Цhkl).

тивораствора. В течение недели вырастали кристаллы (рис. 1б), которые использовались для получения набора дифрагированных кристаллом экспериментальных интенсивностей.

Отсутствие агрегатов в растворе белковой фракции перед ее добавлением в кристаллизационный раствор проверяли методом динамического светорассеяния на спектрометре SpectroSize™ 300 (Molecular Dimensions Limited, Newmarket, Suffolk, United Kingdom, http://www.moleculardi-mensions.com).

Набор экспериментальных интенсивностей рентгеновского излучения, дифрагированного кристаллом нелигандированной YptUPh, собран при температуре 110 К на рентгеновском дифрак-тометре X8 PROTEUM (BRUKER AXS, Madison, USA; http://www.bruker.com/) в Институте белка РАН. Перед экспонированием кристаллы настаивались в течение 30 с в криорастворе, состоящем из противораствора с добавлением в него 40% (о/о) ПЭГ 400.

Обработка дифракционных данных осуществлялась в программе PROTEUM2 (http://www.bruker.com/). Разрешение набора составило 1.70 Â. Значения параметров набора экспериментальных интенсивностей и их характеристики приведены в табл. 1.

Решение и уточнение пространственной структуры нелигандированной YptUPh. Исходная фазовая составляющая стр

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком