МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2004, том 38, № 6, с. 1041-1049
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ БИОПОЛИМЕРОВ И ИХ КОМПЛЕКСОВ
УДК 577.322.7, 577.323.7, 535.56, 543.422.8
СТРУКТУРА КОМПЛЕКСОВ ДНК С НЕГИСТОНОВЫМ ХРОМОСОМНЫМ БЕЛКОМ HMGB1 В ПРИСУТСТВИИ ИОНОВ МАРГАНЦА
© 2004 г. А. М. Поляничко1'2, Е. В. Чихиржина1, Е. И. Костылева1, В. И. Воробьев12*
1Институт цитологии Российской академии наук, Санкт-Петербург, 194064 2Физический факультет Санкт-Петербургского государственного университета, Санкт-Петербург, 198905
Поступила в редакцию 04.12.2003 г.
С помощью метода кругового дихроизма (КД) рассмотрено комплексообразование в системе ДНК-белок HMGBl-ионы марганца. Показано, что в трехкомпонентной системе взаимодействие с ДНК как белка, так и ионов металла отличается от рассмотренных ранее взаимодействий в двухкомпонентных комплексах. Ионы марганца не оказывают влияния на спектр КД свободного белка HMGB1. В то же время ионы Mn2+ вызывают заметные изменения в спектре КД свободной ДНК в области 260-290 нм. Присутствие этих ионов препятствует сборке упорядоченных надмолекулярных ДНК-белковых структур, характерных для комплексов ДНК с белком HMGB1. Взаимодействие ионов марганца с ДНК оказывает существенное влияние на ее структуру, изменяя свойства участков, связывающихся с молекулами белка. Это приводит к серьезному ослаблению кооперативности связывания белка HMGB1 с ДНК. Такие изменения в характере ДНК-белковых взаимодействий наступают уже при концентрациях ионов марганца порядка 0.01 мМ. Более того, нарушения локальной структуры ДНК, вызванные ионами марганца, способствуют появлению новых мест связывания HMGB1 с двойной спиралью ДНК. В то же время нарушения структуры двойной спирали ДНК, вызванные взаимодействием с белком HMGB1, и возрастающие по мере увеличения отношения белок/ДНК, делают ДНК-белковый комплекс особенно чувствительным к ионам марганца. В этих условиях ионы Mn2+ оказывают сильное влияние на структуру ДНК, что отражается в резком изменении спектров КД ДНК в комплексе в области 260-290 нм. Таким образом, структурные изменения двойной спирали ДНК в тройном комплексе ДНК-HMGB1-Mn2+ являются результатом совокупных и взаимно обусловленных взаимодействий с ионами Mn2+ и молекулами белка HMGB1.
Ключевые слова: ДНК-белковые взаимодействия, HMGB1, ионы марганца, круговой дихроизм.
THE STRUCTURE OF THE COMPLEXES OF DNA WITH NON-HISTONE CHROMOSOMAL PROTEIN HMGB1 IN THE PRESENCE OF MANGANESE IONS, by A. M. Polyanichko1,2, E. V. Chikhirzhina1, E. I. Kostyleva1, V. I. Vorob'ev1,2 (institute of Cytology, Russian Academy of Sciences, St.-Petersburg, 194064 Russia; E-mail: Vorobyev@mail.cytspb.rssi.ru; 2Department of Physics, St.-Petersburg State University, St.-Peters-burg, 198905 Russia). The complexes of DNA - HMGB1 protein - manganese ions have been studied using circular dichroism (CD) technique. It was shown that in such three-component system the interactions of both the protein and metal ions with DNA differ from those in two-component complexes. The manganese ions do not affect the CD spectrum of free HMGB1 protein. However, Mn2+ ions induce considerable changes in the CD spectrum of free DNA in the spectral range of 260-290 nm. The presence of Mn2+ ions prevents formation of the ordered supramolecular structures specific for the HMGB1-DNA complexes. The interaction of manganese ions with DNA has a marked influence on the local DNA structure changing the properties of protein-binding sites. This results in the serious decrease in cooperativity of the DNA-protein binding. Such changes in the mode of the DNA-protein interactions occur at concentrations as small as 0.01 mM Mn2+. Moreover, the changes in local DNA structure induced by manganese ions promote the appearance of new HMGB1 binding sites on the DNA double helix. At the same time interactions with HMGB1 protein induce alterations in the structure of the DNA double helix which increase with a growth of the protein/DNA ratio. These alterations make the DNA/protein complex especially sensitive to manganese ions. Under these conditions the Mn2+ ions strongly affect the DNA structure that reflects in abrupt changes of the CD spectra of DNA in the complex in the range of 260-290 nm. Thus, structural changes of the dNa double helix in the three-component DNA-HMGB1-Mn2+ complexes come as a result of the combined and interdependent interactions of DNA with Mn2+ ions and the molecules of HMGB1.
ВВЕДЕНИЕ
Работа посвящена изучению взаимодействия ионов марганца с негистоновым белком хромати-
* Эл. почта: Vorobyev@mail.cytspb.rssi.ru
на HMGB1 (High Mobility Group protein 1) и его комплексами с ДНК. Ранее нами было проведено исследование механизмов взаимодействия ионов марганца с ДНК [1]. Результаты этого исследования, а также данные, полученные ранее другими
авторами, показали, что ионы марганца способны координироваться одновременно к атомам кислорода фосфатных групп и некоторым химическим группам в составе азотистых оснований ДНК. Нами также были определены участки в большой и малой бороздках ДНК, где возможно такое взаимодействие. Однако помимо действия ионов марганца на ДНК, большой интерес представляет вопрос о влиянии ионов металла на ДНК-белковые взаимодействия.
За последние годы появились работы, указывающие на то, что ионы марганца являются необходимыми для функционирования некоторых ДНК-связывающих белков [2, 3], в связи с чем заметно активизировались усилия, направленные на изучение Мп2+-содержащих систем [4-10]. Обсуждая наблюдавшиеся эффекты, авторы некоторых из этих работ высказали предположение, что ионы марганца в одних случаях оказывали стабилизирующее действие на структуру ДНК, тогда как в других случаях они возмущали структуру двойной спирали. Большинство из описанных в этих работах белков обладают одним общим свойством: при своем функционировании каждый из них выполняет ту или иную структурную роль. В то же время, некоторые структурные белки хроматина могут заметно влиять на активность тех регуляторных факторов, которые функционируют в присутствии ионов марганца. Одним из таких структурных белков как раз и является белок НМвБ1, хорошо известный своими необычными ДНК-связывающими свойствами [11, 12]. Ранее разными авторами было показано, что белки семейства НМвБ способны узнавать участки с нарушениями двойной спирали и необычные структуры ДНК, такие как хиазма Хол-лидея [13, 14] и различные перекрестные структуры [15, 16]. Помимо этого, НМвБ-белки при взаимодействии с ДНК способны изгибать ее на угол до 140° [11, 17]. До сих пор окончательно не ясна биологическая роль этих белков в клетке, однако многие авторы полагают, что они выполняют структурную функцию [18, 19]. Иногда НМвБ-белки участвуют в сборке и функционировании достаточно крупных ДНК-белковых комплексов [12, 17, 20, 21]. Не так давно было показано, что белок НМвБ1 может принимать участие в некоторых стадиях рекомбинации [2, 22]. В некоторых случаях обязательным элементом для функционирования таких систем являются ионы марганца.
Единственным косвенным источником информации о влиянии ионов металлов на взаимодействие НМвБ1 с ДНК могут служить ранние работы других авторов, изучавших влияние ионов кальция и некоторых других двухвалентных металлов [23-25]. Однако можно привести как минимум два обстоятельства, указывающие на необходимость постановки отдельного эксперимента для Мп2+-со-держащих систем. Во-первых, механизм действия
на молекулу ДНК рассмотренных ранее ионов отличен от действия ионов марганца. Во-вторых, за истекшее время достаточно сильно изменились наши представления о механизмах взаимодействия с ДНК самих HMGB-белков. Тем не менее, до сегодняшнего дня не было проведено исследований, направленных на изучение влияния ионов марганца на ДНК-связывающие свойства белка HMGB1. В своей работе мы попытались восполнить существующий пробел, используя методы кругового дихроизма и абсорбционной спектроскопии в УФ-области, что стало одной из первых попыток спектрального изучения таких систем.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
УФ-спектроскопия. Круговой дихроизм комплексов ДНК-HMGBl регистрировали на дихро-графе CD6 ("Jobin Yvon", Франция) в кварцевых кюветах с длинами оптических путей в интервале 0.1-1 см в области 190-320 нм. Параллельно с измерением кругового дихроизма проводили контроль за спектрами изотропного поглощения образцов.
Спектры кругового дихроизма представлены в виде разности поглощения лево- и правополяризо-ванного лучей ДА = (AL - AR). В тех случаях, когда необходимо анализировать спектры многокомпонентной смеси, использование приведенных величин (например, молярной эллиптичности [6]) не вполне удобно. Это связано с тем, что могут существовать спектральные области, в которых регистрируемый спектральный эффект представляет суперпозицию сигналов от отдельных компонентов в смеси. В нашем случае происходит наложение спектральных полос белка и ДНК в области длин волн, меньших 250 нм.
Материалы. Негистоновый хромосомный белок HMGB1 (26 500 Да) из тимуса теленка получен по описанной ранее методике [26]. Контроль чистоты и идентификацию белка осуществляли методом электрофореза и иммуноферментным методом с помощью полученных в нашей лаборатории антител к белку HMGB1. Электрофорез проводили в 15%-ном полиакриламидном геле в присутствии додецил сульфата натрия [27]. Концентрацию белка определяли спектрофотометри-чески, используя коэффициент экстинкции е280 = = 33000 М-1 см-1 [28].
В работе использовали высокомолекулярную ДНК тимуса теленка ("Sigma"). Концентрацию ДНК определяли по величине поглощения растворов после ее гидролиза в присутствии 6%-ной хлорной кислоты [29]. Нативность препарата контролировали по величине гиперхромного эффекта при денатурации.
Искусственные ДНК-белковые комплексы готовили путем прямого смешения равных объемов
компонентов в растворе 15 мМ NaCl [30]. Конечная концентрация ДНК в комплексе составляла 10-300 мкг/мл. Количество белка в комплексе определяли, исходя из весового соотношения r белок/ДНК в растворе, которое выбиралось в интервале от 0.1 до 2.0.
В эк
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.