МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 84, № 4, с. 476-484
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ СТАТЬИ
УДК 579.26574.584
СТРУКТУРА СООБЩЕСТВА АРХЕЙ В ФОТИЧЕСКОЙ ЗОНЕ ВОДНОЙ ТОЛЩИ ЧЕРНОГО МОРЯ
© 2015 г. А. Ю. Меркель1, В. А. Корнеева1, 2, И. Ю. Тарновецкий1, 2, А. Л. Брюханов1, 2, В. К. Часовников3, Е. А. Таранов1, С. В. Тощаков4, Н. В. Пименов1, *
Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук, Москва 2Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва 3Южное отделение Института океанологии им. П.П. Ширшова Российской академии наук, Геленджик 4Балтийский федеральный университет имени Иммануила Канта, Калининград Поступила в редакцию 01.12.2014 г.
Проведен качественный и количественный анализ структуры сообщества архей в фотической зоне водной толщи Черного моря. Методом ПЦР в реальном времени установлено, что численность архей на глубине 15 м составляет 2 х 104 кл/мл или 4.2% от общей микробной популяции. С использованием технологии секвенирования путем синтеза (метод Illumina/Solexa) ампликонов гена 16S рРНК впервые изучена структура сообщества архей подповерхностной водной толщи. Наиболее многочисленная группа архей была представлена филогенетическим кластером Маппе Group II, относящимся к филуму Euryarchaeota. Их численность в зоне исследуемого района составила 1.2—1.7 х 104 кл/мл. Вторым по численности (40% от свободноживущей популяции архей или 7.7 х 103 кл/мл) оказался филогенетический кластер Marine Group I, относящийся к филуму Thaumarchaeota. Среди последовательностей Marine Group I на основании высокого уровня сходства (выше 90%) были выявлены последовательности кластера 'Nitrosopumilus'. Также удалось детектировать группу архей, принадлежащих к кластеру некультивируемых микроорганизмов Deep-sea Hydrothermal Vfent Euryarchaeotic Group 6 (DHVEG-6) филума Euryarchaeota. Последовательности гена 16S рРНК, отнесенные к данному кластеру, были выявлены только во фракции взвеси. Большая часть последовательностей DHVEG-6 на основании высокого уровня гомологии (более 90%) была отнесена к кластеру 'Parvarchaeum'. Интересно, что, несмотря на заметный пик метана, наблюдаемый на глубине 15 м, детектировать последовательности метаногенов не удалось.
Ключевые слова: структура сообщества архей, ПЦР в реальном времени, ген 168 рРНК, фотическая зона, водная толща, Черное море.
DOI: 10.7868/S0026365615040126
Уже более 100 лет назад установлено, что Черное море является самым большим на Земле ме-ромиктическим водоемом, анаэробные воды которого содержат значительные количества растворенного сероводорода, метана и углекислого газа.
Существенные отличия в минеральном и газовом составе поверхностных и глубинных вод Черного моря способствуют развитию на разных глубинах специфических микробных сообществ, осуществляющих важнейшие биогеохимические процессы круговорота основных биогенных элементов, необходимых для функционирования экосистемы Черного моря. Традиционно большой интерес для микробиологов представляет зона контакта поверхностных кислородсодержа-
* Автор для корреспонденции (e-mail: npimenov@mail.ru).
щих и глубинных бескислородных вод (редокс-зона). По геохимическим параметрам эта зона крайне неоднородна и представлена относительно тонкими слоями максимумов химических компонентов, состав и содержание которых определяется окислительно-восстановительным уровнем среды [1].
В серии работ отечественных и зарубежных исследователей радиоизотопными, изотопно-геохимическими, прямыми микробиологическими и молекулярно-биологическими методами установлено, что в верхней части редокс-зоны присутствуют облигатно аэробные литотрофные и метанотрофные бактерии, осуществляющие хемосинтез и окисление метана. Наряду с классическими аэробами в нижней части редокс-зоны обнаружены факультативные и облигатно анаэробные микроорганизмы, участвующие в анаэробном
окислении серных соединений, метана, аммония и в разложении органического вещества [2—5].
Первые данные о вертикальном распределении архей в водной толще были получены более 10 лет назад [2] методом флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) с использованием универсального архейного зонда ARCH915. Авторами обнаружено присутствие архей не только в глубинных сероводородных водах, но также и в кислородсодержащем поверхностном и холодном промежуточном слое (ХПС) Черного моря. Предполагалось, что выявление архей (до 10 тыс. кл/мл) в аэробных водах, а также наличие пика метана в аэробных водах на глубине 20—40 м может быть объяснено выделением этого газа из кишечника зоопланктона, а также формированием анаэробных микрониш в пеллетах и других крупных частицах органической взвеси [6].
В последние десятилетия накоплен большой материал о том, что наряду с бактериями, археи практически повсеместно распространены в водной толще морских и пресных водоемов и составляют значительную часть пикопланктона [7—9].
По данным Лин (Lin) и соавт. среди черноморских архей как в пределах редокс-зоны, так и в глубинных водах доминировала группа I Crenar-chaeota [10]. Попытки выяснить, какую экофи-зиологическую роль играют археи в водной толщи Черного моря ограничиваются несколькими публикациями [11, 12], в которых представлены доказательства участия этих микроорганизмов в окислении аммония. Генетические (16S рДНК, архейный ген amoA) и липидные (кренархеол) маркеры пелагических морских кренархеот обнаружены в верхних слоях редокс-зоны, где концентрация кислорода не превышает 1 мкМ. Предполагается, что аммоний-окисляющие археи, функционирующие на границе окисленных и восстановленных вод, образуют нитрит, который используется анаэробными планктомицетами для "anammox" реакции [12, 13].
Несмотря на существенный методический прогресс в изучении сообществ архей, до сих пор крайне ограничены исследования по выявлению филогенетического разнообразия и геохимической роли этих микроорганизмов в составе пико-планктона водной толщи Черного моря. Практически отсутствуют данные о таксономическом и функциональном разнообразии архей в поверхностных окисленных водах фотической зоны Черного моря. Целью данной работы было изучение молекулярно-биологическими методами распространения архей в водах фотической зоны глубоководного района Черного моря.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объекты исследования. В работе исследовали воду из аэробной зоны с глубины 15 м, отобранную в июле 2014 г. с борта промыслового морского бота "Ашамба" ИО РАН на станции с глубиной 1200 м, расположенной в пределах континентального склона российского сектора Черного моря (44°491 N, З7°87З Е) в районе Геленджика. Для отбора проб использовали 5 л батометры зондирующего комплекса типа "Rosette", оснащенного гидрофизическим зондом фирмы "Sea-Bird Electronics, Inc." (США) с датчиками температуры, солености и давления. Для общего описания профиля водной толщи изучаемого района отбирали образцы из аэробной зоны в интервале глубин 0—1З0 м из характерных гидрохимических слоев Черного моря — фотическая зона (З, 10, 15, 20, 25, З0 м) и холодный промежуточный слой, ХПС (50, 110, 1З0 м). На борту судна образцы воды с соответствующих глубин разливали по склянкам для определения содержания О2, нитратов, нитритов, аммония и метана. Определения гидрохимических параметров проводили по стандартным методикам, используемым в лаборатории химии ЮО ИО РАН, метана — в лаборатории ИНМИ РАН хроматографическим методом на газовом хроматографе "Кристалл" с пламенно-ионизационным детектором.
Микробиологические анализы. Для определения общей численности клеток микроорганизмов использовали окрашенные ДАФИ мембранные фильтры (GTBP 2500 (диаметр 25 мм, размер пор 0.2 мкм) производства "Millipore" (США) с нитро-целлюлозной подложкой (диаметр 25 мм, размер пор 0.45 мкм) при увеличении x1000. Подсчет клеток проводили на эпифлуоресцентном микроскопе Axio Imager D1 ("Carl Zeiss", Германия), используя компьютерное программное обеспечение Axio Vision.
Отделение взвеси проводили на крупнопористых стекловолоконных фильтрах GF/C ("Whatman", Великобритания), задерживающих частицы размером более 1.2 мкм, и последующей фильтрацией образцов на мембранных фильтрах с диаметром пор 0.22 мкм ("Millipore", США). Для каждой пробы с исследуемого горизонта водной толщи фильтровали около 5 л морской воды. На фильтрах GF/C, задерживающих объекты размером более 1.2 мкм, в основном концентрировались крупные частицы, которые могли содержать в себе клетки, ассоциированные с взвесью, а на мембранные фильтры оседали мелкие частицы, представленные, главным образом, свободноживущими микроорганизмами. Фильтры со сконцентрированной на них биомассой были зафиксированы в
буфере, содержащем 0.15 M NaCl и 0.1 M Ш2ЭДТА (pH 8.0).
Молекулярно-биологические методы и биоин-форматический анализ данных. Выделение ДНК производили, согласно ранее опубликованной методике [14] с некоторыми модификациями: для разрушения клеток использовался гомогенизатор FastPrep® 24 ("MP Biomedicals", США). Качественную и количественную оценку полученных препаратов ДНК проводили на спектрофотометре DropSense-96® ("Trinean", Бельгия). ПЦР производили согласно стандартному протоколу [15]. Для амплификации фрагмента гена архейной 16S рРНК использовали праймеры Univ515F [16]— Arch915R [17]. Для амплификации фрагмента гена mcrA использовали праймеры mlas—mcrA-rev [18]. Для дальнейшего секвенирования полученные ам-пликоны разделяли с помощью электрофореза в агарозном геле, вырезанные из геля ампликоны очищали с помощью набора для очистки ДНК из геля и реакционных смесей Cleanup Standard ("Евроген", Россия). Мультиплексные библиотеки ампликонов для секвенирования на системе MiSeq ("Illumina", США) были подготовлены при помощи набора NEBNext® для фрагментных библиотек ("New England BioLabs", США). Секвени-рование проводили при помощи набора реагентов, обеспечивающего длину прочтения 300 нук-леотидов с каждого конца ампликона. Первичная обработка (фильтрация и демультиплексирование) полученных прочтений производили при помощи ПО CLC Genomics Workbench 7.5 ("Qiagen", США). Полученные данные были обработаны с помощью онлайн сервиса SILVAngs (https://w
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.