ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 577.112:579.861.043:535.31
СТРУКТУРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И ЗАЩИТНОЕ ДЕЙСТВИЕ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ПЕПТИДНЫХ МЕТАБОЛИТОВ LUTEOCOCCUS JAPONICUS SUBSP. CASEI НА ПРОБИОТИЧЕСКИЕ БАКТЕРИИ
© 2015 г. Л. И. Воробьева*, Е. Ю. Ходжаев*, Е. А. Рогожин**, В. А. Самойленко***, Н. В. Харченко*
*Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет **Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова
Российской академии наук, Москва ***Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук, Пущино Поступила в редакцию 19.01.2015 г.
Исследовано стрессозащитное действие экзометаболитов Luteococcusjaponicus subsp. casei в отношении клеток транзиторных пробиотических бактерий штаммов рода Propionibacterium, Enterococcus faecium и дрожжей Saccharomyces cerevisiae Boulardii, подвергаемых действию желчных солей и кислотному стрессу. Защитным действием обладали: (1) внеклеточный пептидный реактивирующий фактор (РФ) и (2) пептидный компонент культуральной жидкости после выделения из нее РФ. Протекторное (превентивное внесение) и реактивирующее (после воздействия стрессора) действие РФ приводило к увеличению (в 1.5—2.0 раза) выживаемости транзиторных пробиотиков человека P. freudenreichii, P. acidipropionici и E. faecium, обработанных желчными солями (ЖС) или подвергнутых кислотному стрессу. Пептидная фракция КЖ обладала более сильным протекторным действием. В вариантах предынкубации с ней клеток P. acidipropionici их выживаемость в тех же стрессовых условиях увеличивалась в 14 (действие ЖС) и 8 (кислотный стресс) раз по сравнению с контролем. Дрожжи проявляли исключительно высокую устойчивость к действию применяемых стрессоров. Установлено, что в состав РФ входят две активные фракции гликопептидов с молекулярными массами 1.8 и 2.4 кДа. При определении аминокислотного состава гликопептидов в них обнаружены остатки глицина, лейцина, пролина, аргинина, аспартата/аспарагина и не найдено остатков ароматических и серосодержащих аминокислот, а также посттрансляционных модификаций по типу образования дисульфидных мостиков. Обсуждаются возможные механизмы реактивирующего и протекторного действия РФ.
Ключевые слова: внеклеточные метаболиты микроорганизмов, стресс, протекторное и реактивирующее действие, транзиторные бактерии, пробиотики, пребиотики.
DOI: 10.7868/S0026365615040187
В симбиозе с человеком существуют порядка 1014 клеток микроорганизмов, а в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) содержится около 1 кг бактерий [1], представленных более чем 500 бактериальными видами. Совокупность всех микробиоценозов человека или животных рассматривают как экстракорпоральный орган, количество клеток в котором в 10—100 раз больше общего числа клеток всех тканей и органов хозяина [2]. Имеется тесная связь между нарушением микробиоценоза кишечника и органическими и функциональными патологиями не только ЖКТ, но и других органов и систем организма. При нарушении микробиоценоза пробиотики применяют перорально в
1 Автор для корреспонденции (e-mail: livorobjeva@mail.ru).
лиофилизированном виде, либо в составе молочных и некоторых других продуктов. Однако выживаемость пробиотических микроорганизмов в ЖКТ экспериментальных животных составляет 0.001% от их исходной численности при перо-ральном поступлении [3]. Одна из причин отсутствия приживаемости — негативное влияние агрессивной эндогенной среды при транзите бактерий по ЖКТ — кислотность желудочного сока, сменяющая ее щелочная среда тонкой кишки, желчь, ферменты, иммуноглобулины, повышенное осмотическое давление, ограниченность в питательных веществах и другие.
Наряду с пероральным введением пробиотиков, существует и другой подход к лечению дис-биотических состояний, предусматривающий
восстановление собственной микрофлоры. Этот подход основан на том, что главным действующим фактором восстановления нормальной микрофлоры являются не сами клетки, а продукты их жизнедеятельности, хотя некоторые из них, наоборот, "тормозят" процесс эффективного восстановления собственной нормофлоры [4].
К пребиотикам относят вещества различного происхождения и строения (пищевые волокна, олигосахариды, полисахариды, моносахариды, спирты, пептиды, некоторые витамины с антиок-сидантными свойствами и ряд других веществ), обладающие селективным эффектом на развитие полезной микробиоты. Они могут выступать в качестве регуляторов рН и редокс-потенциала, рецепторов для "дружественных" или блокаторов рецепторов для "нежелательных" микроорганизмов в конкретных экологических нишах ЖКТ [2], что оказывает благоприятное действие на здоровье хозяина. Изучение природы таких веществ представляет большой теоретический и практический интерес.
Ранее из культуральной жидкости (КЖ) L. casei был выделен пептидный реактивирующий фактор (РФ), обладающий как реактивирующим, так и протекторным действием в отношении бактерий, архей, низших и высших эукариот [5], подвергающихся летальным стрессорным воздействиям. Нами было показано, что данный РФ представлен комплексом, в состав которого входят две активные фракции пептидов, содержащих гликозидные связи [6]. Однако оказалось, что в КЖ L. casei, помимо РФ, содержится также другая, активная в отношении защиты клеток от стресса фракция пептидной природы.
РФ и пептидная фракция (КЖ, освобожденная от РФ), увеличивали устойчивость резидентной микрофлоры (молочнокислых и бифидобак-терий) к желчным солям, кислотности среды и лиофильному высушиванию [7]. Бифидобактерии и лактобациллы относят к классическим пробио-тикам, так как они основаны на штаммах, выделенных из кишечника человека и доминирующих в нем с первых дней жизни хозяина. Пробиотиче-ские свойства, хотя и транзиторные, присущи и другим представителям нормальной микрофлоры человека, средой обитания которых являются не ЖКТ, а ферментированные кисломолочные продукты и некоторые другие природные субстраты.
Транзиторные пробиотики обладают колонизационной резистентностью, имеют иммуногенную и антимутагенную функции, способствуют селективному размножению представителей нормо-флоры, ингибируют рост и способность к адгезии потенциально патогенных микроорганизмов. К транзиторным пробиотикам относят представителей родов Enterococcus, Propionibacterium, Sac-charomyces, Streptococcus, Lactococcus, Leiconostoc,
из которых главное значение имеют бактерии первых трех родов.
Пропионовокислые бактерии (ПКБ), ранее широко используемые в пищевой промышленности, в производстве витаминов и кормов [8, 9], в последние годы рассматривают как перспективные пробиотики [10]. Комплекс пробиотических свойств ПКБ [10, 11] позволяет видеть в них альтернативу классическим пробиотикам — бифидобакте-риям, хотя уровень адгезии ПКБ в ЖКТ составляет лишь 0.2—0.6% от всех внесенных бактерий, в то время, как уровень адгезии лактобацилл и бифи-добактерий значительно выше: от 1.3 до 24% [12]. Однако показано, что адгезия ПКБ в кишечном тракте (КТ) может быть значительно повышена путем предварительной адгезии на клетках про-биотических штаммов лактобацилл или бифидо-бактерий [13].
Устойчивость к пищеварительным стрессам является для ПКБ существенным фактором, определяющим эффективность использования этих микроорганизмов как живых пробиотиков. Путем предварительной адаптации P. freudenre-ichii к желчным солям [13] и кислотности [14] удавалось повысить устойчивость бактерий к указанным стрессовым воздействиям, что сопровождалось синтезом адаптивных белков [13, 14], при этом способность к адаптации являлась штаммозави-симой.
Среди энтеробактерий в пищеварительном тракте людей и животных наиболее часто присутствуют E. faecium и E. faecalis [2]. Существуют клинические и пробиотические штаммы E. faecium [15]. Все штаммы E. faecium, содержащиеся в пробиотических продуктах, устойчивы к ванкомицину и не продуцируют токсины [16]. E. faecium применяют в педиатрии в составе различных пробиотических препаратов [17], в том числе в сочетании с лакто-бациллами [18]. Многие штаммы E. faecium обладают антимутагенной активностью [19]. Клетки E. faecium, выделенные из коровьего молока, образуют значительное количество кислот и проявляют высокую устойчивость к кислотному стрессу и ЖС [20], а также эффективные барьерные функции в мукозном слое кишечника за счет собственной адгезии и ингибирования адгезии энте-ропатогенных бактерий [21]. Таким образом, E. faecium обладает выраженными пробиотиче-скими свойствами.
Из дрожжей рода Saccharomyces к пробиотикам относят только штаммы S. cerevisiae Boulardi, клетки которого подавляют рост культур Vibrio cholerae, Escherichia coli, Salmonella typhi, Clostridium difficile [22]. Дрожжи способствуют росту и выживаемости пробиотических бактерий, благодаря образованию пептидов, аминокислот и витаминов [23], увеличивают стабильность и время жизни пробиотических бактерий в ферментированном
молоке, снижают риск и длительность течения антибиотико-зависимой диареи [18].
Целью настоящей работы являлись структурный анализ активных фракций РФ L. casei и изучение их защитного действия, а также действия пептидной фракции КЖ в отношении транзитор-ных пробиотических микроорганизмов — бактерий родов Propionibacterium, Enterococcusfaecium и дрожжей Saccharomyces cerevisiae Boulardii.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты исследования и их культивирование.
Пропионовокислые бактерии Propionibacterium freudereichii 1857, P. acidipropionici 1859, P. acnes 3322, P. technicum 1864, P. thoenii 1865, P. globosum 3323 получены из Чешской коллекции микроорганизмов (ССМ), Enterococcus faecium M З185 получен из ВКМ РАН, Bifidobacterium bifidum КМ-23 и дрожжи Saccharomyces cerevisiae Boulardii КМ-13 — из музея кафедры микробиологии МГУ.
Бактерии Luteococcus japonicus subsp. casei выращивали в статических условиях в колбах на 100 мл при 32°C на глюкозо-минеральной среде следующего состава (%): глюкоза — 1.0, (NH4)2SO4 — 0.3, KH2PO4 - 0.1, Na2HPO4 - 0.2, MgSO4 - 0.002, CaCl2 — 0.002, NaCl — 0.002, дрожжевой экстракт — 0.1, pH 7.0 поддерживали 5%-ным раствором NaOH. Культуральная ж
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.