МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2004, том 38, № 2, с. 297-302
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ
УДК 579.842:578.81.08
СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И КОНТРОЛЬ ЭКСПРЕССИИ sop-ОПЕРОНА ЛИНЕЙНОГО ПЛАЗМИДНОГО ПРОФАГА N15
© 2004 г. Н. В. Равин*, Б. Д. Дорохов, D. Lane1
Центр "Биоинженерия" Российской академии наук, Москва, 117312 laboratoire de Microbiologie et Génétique Moléculaire, IBCG, CNRS, Toulouse, France, 31062
Поступила в редакцию 17.07.2003 г.
Стабильное наследование бактериальных хромосом и низкокопийных плазмид зависит от правильного распределения реплицированных молекул между дочерними клетками, механизм которого изучен для кольцевых плазмид F и P1. На примере бактериофага N15, который в лизогенном состоянии не интегрируется в хромосому Escherichia coli, а представляет собой линейную плазмиду с ко-валентно замкнутыми концами, изучали механизм сегрегационной стабильности линейных репли-конов. Стабильное наследование N15 обеспечивается локусом sop, обладающим гомологией с sop-локусом плазмиды F. Проанализирован механизм экспрессии sop-генов бактериофага N15. Промотор sop-оперона содержит сайт связывания бактериального белка IHF, а также пять копий последовательности CTTTGC, которые перекрывают участки -35 и -10. Показано, что Sop-белки связываются in vitro с фрагментом ДНК, содержащим промотор sop. Транскрипция оперона sop регулируется Sop-белками: продукт первого гена, SopA, репрессирует промотор, в то время как продукт второго гена, SopB, усиливает репрессию. SopB не влияет на активность промотора в отсутствие SopA. Показано, что промотор sop действительно репрессирован в лизогенной по N15 культуре бактериальных клеток. Этот механизм регуляции оперона sop обеспечивает синтез белков SopA и SopB в строго определенных количествах, необходимых для функционирования механизма сегрегационной стабильности, и устраняет случайные флуктуации их внутриклеточной концентрации.
Ключевые слова: бактериофаг N15, плазмида, сегрегационная стабильность, промотор, sop.
Стабильное наследование бактериальных хромосом и низкокопийных плазмид обеспечивается правильным распределением реплицированных молекул между дочерними клетками. Этот процесс функционально аналогичен митозу у эукари-от. В большинстве случаев за сегрегационную стабильность отвечает отдельный локус, включающий оперон из двух генов и центромерный сайт. Изучение сегрегационных локусов бактериальных плазмид, таких как F-фактор и профаг Р1 [1-3], выявило ряд закономерностей их структурной и функциональной организации. Первый ген (parA/sopA) кодирует белок, который связывается с промотором оперона sop и подавляет транскрипцию, в то время как продукт второго гена (parB/sopB) связывается с центромерой, формируя сегрегационный комплекс, а также участвует в репрессии промотора [4-9]. Предполагается, что в результате взаимодействия этих сегрегационных комплексов реплицированные плазмид-ные ДНК образуют пары. Затем неизвестные клеточные факторы при участии белка SopA разделяют пары и переносят составляющие их плазмиды к противоположным концам делящейся клетки [10, 11]. Точная работа этого механизма
* Эл. почта: nravin@biengi.ac.ru
требует строго определенных и сбалансированных количеств белков Sop, что достигается регуляцией экспрессии оперона по механизму отрицательной обратной связи - SopA репрессирует промотор, причем SopB усиливает эту репрессию.
Приведенные принципы функционирования механизмов сегрегационной стабильности применимы к кольцевым низкокопийным плазмидам и, в ряде случаев, к бактериальным хромосомам. В то же время механизмы, обеспечивающие стабильное наследование линейных прокариотических репликонов, практически не изучены.
Мы начали изучение этого механизма на примере умеренного бактериофага N15, который не интегрируется в хромосому в лизогенном состоянии, а представляет собой линейную плазмиду с ковалентно замкнутыми концами [12-14]. Помимо N15 такую структуру ДНК имеют линейные плазмиды и хромосомы спирохет Borrelia [15], фаг pY54 Yersinia enterocolitica [16], а также одна из хромосом Agrobacterium tumefaciens [17]. После попадания в клетки Escherichia coli линейная ДНК N15 замыкается в кольцо по липким концам, как и при заражении клеток фагом X (рис. 1). Затем специальный фаговый фермент, протело-мераза (прокариотическая теломераза), разреза-
cosL
telRL
telN
cosR
sop
Циркуляризация telRL -+JelN
Фаговая ДНК
telL telN
С
Разрезание сайта telRLпротeломeразой и образование ковалентно замкнутых теломер cosRL
О
sop telR ДНК профага
telL
О
Двунаправленная репликация с внутреннего ori
telLL
telR
telRR
Образование шпилечных теломер протеломеразой
telL
С С
telR
О
О
telL
telR
Рис. 1. Преобразование фаговой ДНК в линейную плазмиду после инфекции (а) и модель репликации линейного плазмидного профага (•). cosL, cosR - од-нонитевые липкие концы, cosRL, cos - сайт после замыкания и лигирования; telRL - сайт действия проте-ломеразы; telL и telR - левая и правая шпилечные те-ломеры профага, образуемые при помощи проте-ломеразы. Направление транскрипции гена протело-меразы (telN) и sop-оперона показано стрелками.
ет в кольцевой молекуле другой сайт, telRL, и образует шпилечные концы (теломеры, [18]).
Стабильное наследование плазмиды N15 обеспечивается локусом sop, который обладает гомологией с sop-локусом плазмиды F как в области структурных генов (sopA, sopB), так и в содержащем промотор sop-оперона, Psop [19] участке размером около 150 н. перед геном sopA. Однако изучение механизма сегрегационной стабильности фага N15 выявило существенные отличия от модели, принятой для кольцевых плазмид. Так, цен-тромерный сайт N15 не является совокупностью инвертированных повторов, расположенных непосредственно рядом с sop-опероном, но представлен четырьмя повторами, распределенными по геному N15. Каждый такой сайт функционирует как центромера [19, 20]. Существуют данные,
свидетельствующие о том, что sop-оперон N15 не только обеспечивает сегрегационную стабильность профага, но и выполняет функции, связанные с контролем репликации ДНК и экспрессии генов фага. В то же время, sop-опероны кольцевых плазмид представляют собой функционально изолированные генетические модули. Наконец, анализ нуклеотидной последовательности, предшествующей гену sop A N15, позволил обнаружить несколько потенциальных промоторов помимо Psop.
Изучение сегрегационной стабильности N15 и ее взаимосвязи с контролем репликации ДНК и экспрессии генов требует идентификации механизмов, регулирующих экспрессию sop-генов. В данной работе мы изучали структурную организацию промотора Psop фага N15 и регуляцию его экспрессии.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Среды, реактивы, ферменты и синтетические олигонуклеотиды. Бактерии E. coli выращивали в LB-бульоне или на чашках с LB-агаром при 37°С. В случае необходимости в среды добавляли антибиотики ампициллин (100 мкг/мл) и канамицин (50 мкг/мл). Р/и-ДНК-полимеразу ("Promega"), Т4-ДНК-лигазу, фрагмент Кленова ДНК-поли-меразы, Т4-полинуклеотидкиназу ("New England Biolabs") и эндонуклеазы рестрикции ("Promega", "New England Biolabs", "Сибэнзим") использовали в соответствии с рекомендациями производителя. Использовали следующие синтетические олигонуклеотиды:
PR3 (TTGAATTCCAACGTAAGTAATACCGTTG); PR23 (CCGGATCCTGACCGCGATTGATAC).
Бактериальные штаммы, бактериофаги и плазмиды. Штамм E. coli МС1061 [21] использовали для размножения бактериофагов X и N15, в остальных случаях использовали штамм DH10B [22]. Нумерация нуклеотидов в геноме N15 соответствует последовательности, представленной в GenBank (AF064539; [23]). Гены sopA, sopB и оба гена одновременно экспрессировали в составе плазмид pDAG408, pDAG407N и pDAG242 соответственно [24]. Фрагмент ДНК N15, содержащий промотор sop-оперона (от -183 до +47 н. относительно А в ATG-кодоне гена sopA), получен при помощи ПЦР с использованием праймеров PR3 и PR23. Этот фрагмент клонировали по EcoRI- и 5атН1-сайтам, расположенным перед геном lacZ, в векторе pRS551 [25]. Репортерную конструкцию Psop-lacZ переносили в хромосому E. coli при помощи рекомбинации in vivo и лизогенизации штамма MC1061 рекомбинантным фагом XRS88 [25] и получили штамм рNSP06chr.
Определение активности промотора sop. Опыты проводили, используя штамм pNSP06chr или этот же штамм, содержащий плазмиды, экспрес-сирующие гены sop. Бактерии выращивали в
а
СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И КОНТРОЛЬ ЭКСПРЕССИИ ^-ОПЕРОНА
299
LB-бульоне при 37°C до OD600 = 0.2-0.4. Активность Р-галактозидазы определяли согласно [26].
Получение белковых экстрактов. Культуры DH10B/pUC9 и DH10B/pNR213 (pUC9 с клонированными генами sop A и sopB бактериофага N15) растили при 37°С на качалке до достижения OD600 = 0.3, вносили изопропил-1 -тио-Р^-галактопиранозид (IPTG) до 1 мМ и культивировали еще 3 ч. Клетки в количестве, соответствующем 10 мл раствора с OD600 = 2.0, собирали центрифугированием и ре-суспендировали в 450 мкл раствора, содержащего 10 мМ Трис-HCl рН 8.0, 1 мМ EDTA, 100 мМ NaCl, 20% сахарозы. Белковый состав бактериальных культур анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) [27].
Для получения препарата белков клетки лизи-ровали лизоцимом (0.4 мг/мл, 15 мин при 4°С) с последующей обработкой ультразвуком. Клеточный дебрис удаляли двухкратным центрифугированием при 14000 g в течение 15 мин при 4°С.
Концентрацию белков в супернатанте определяли при помощи набора BioRad Protein Assay Kit ("Biorad"), следуя указаниям производителя. Препараты белков разводили до концентрации 400 мкг/мл в реакционном буфере, содержащем 50 мМ HEPES-KOH (pH 7.5), 50 мкМ NaCl, 10 мкМ MgCl2, 10% глицерина, 100 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина, 100 мкг/мл ДНК спермы лосося и 1 мМ дитиотреитола.
Получение радиоактивно меченных ПЦР-фрагментов. Фрагмент ДНК бактериофага N15 длиной 200 н., содержащий промотор sop-оперо-на, получен при помощи ПЦР с использованием праймеров PR3 и PR24. Контрольный ПЦР-фраг-мент длиной 143 н., не содержащий Psop N15, получен с использованием праймеров PR24 и F18 и ДНК плазмиды pNR-SOE3 [24]
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.