МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2004, том 38, № 2, с. 203-212
К 100-ЛЕТИЮ СО ДНЯ РОЖДЕНИЯ A.A. БАЕВА ОНКОГЕНОМИКА =
УДК 575.2.232.52
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЛАСТИ 13qi4 ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА И ПОИСК В НЕЙ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ГЕНОВ-СУПРЕССОРОВ ОПУХОЛЕВОГО РОСТА
© 2004 г. А. В. Баранова1'2, Д. В. Иванов1,2, Т. В. Тяжелова1, Н. К. Янковский1*
1Институт общей генетики им. НИ. Вавилова Российской академии наук, Москва, 119991 2Molecular and Microbiology Department, George Mason University, Fairfax VA, USA Поступила в редакцию 02.09.2003 г.
Кратко описаны исследования по картированию хромосомы 13 в рамках Российской национальной программы "Геном человека". Приведены результаты изучения района 13q14.3, который часто утрачивается в клетках некоторых опухолей человека и может содержать гены, активность которых препятствует возникновению опухолей. Изложена схема поиска таких генов. По мере развития разрешающей способности анализа генома была определена минимальная общая область хромосомы 13, утрачиваемая у больных хроническим B-клеточным лимфолейкозом (В-ХЛЛ). Построена карта экспрессирующихся участков района, содержащего минимальную делетируемую область, и определены гены-кандидаты на роль гена-супрессора опухолевого роста, расположенного в области 13q14. Проведен структурно-функциональный анализ генов-кандидатов и рассмотрены возможные функции этих генов в онкогенезе. Предложена новая стратегия поиска мутаций для выявления потенциального гена-супрессора в области 13q14, основанная на гипотезе о гаплонедостаточности как механизме генетического контроля развития В-ХЛЛ.
Ключевые слова: геном человека, гены-супрессоры опухолевого роста, хромосома 13, 13q14, хронический B-клеточный лимфолейкоз.
ВВЕДЕНИЕ
Предположение о существовании генов, чьи повреждения связаны с предрасположенностью к развитию злокачественных заболеваний, впервые было высказано в начале 70-х годов XX века в работах Кнудсона, описывающих двухударную модель развития ретинобластомы [1, 2]. С тех пор открыты и хорошо изучены более 20 генов-суп-рессоров опухолевого роста (tumor suppressor genes, TSG [3]), потеря которых способствует развитию опухолей, и около 100 генов-кандидатов, о четкой причинно-следственной связи повреждений которых с определенными опухолевыми фенотипами судить еще рано. Поскольку восстановление функции некоторых генов-супрессоров в опухолевых клеточных линиях приводит к существенному замедлению пролиферации клеток или даже к реверсии опухолевого фенотипа, поиск новых генов-супрессоров и исчерпывающее описание функций уже известных генов этого класса является одной из главных задач геномики опухолей.
Очевидно, что успешное завершение этих фундаментальных исследований должно иметь приложения в практической медицине в виде ДНК-диа-гностикумов на "рисковые" аллели генов-супрессоров, а также на специфически измененный спектр их экспрессии. В дальнейшем такие гены
* Эл. почта: Yankovsky@vigg.ru
могут стать одним из компонентов генотерапии опухолевых заболеваний.
В девяностых годах XX века стратегия поиска генов-супрессоров опухолевого роста исходила из принципов "обратной генетики" - сначала определяли приблизительное положение гена в геноме, чтобы установить, к какой хромосоме и какому хромосомному району он принадлежит. Этот уровень картирования основывался на методах цитогенетики, поскольку в опухолевых клетках часто наблюдается потеря целых хромосом или их фрагментов, которые, как полагают, и содержат ген-супрессор. Предел разрешающей способности картирования составляет при этом примерно 4 млн.п.н., т.е. соответствует размеру полосы, выявляемой при специфической окраске хромосом (G-banding). Поскольку такой интервал в геноме человека содержит в среднем около 100 генов, то для минимизации района хромосомы, содержащего потенциальный ген-супрессор, проводили следующий этап картирования. Искомый интервал насыщали такими маркерами, как STS, STR, космиды, YAC- и кДНК-клоны, определяли расстояние между ними и взаимное расположение, т.е. проводили тонкое физическое картирование. Маркеры полученной карты использовали для анализа присутствия или отсутствия соответствующих микрофрагментов генома в опухолевой ДНК. Результатом этого этапа было построение карты делеций и установление минимального об-
щего района генома человека, перекрываемого делециями в ДНК больных из данной выборки. Минимальный общий район ДНК секвенировали, экспериментально выявляли локализованные в нем гены и определяли их структуру. Исходя из структурных особенностей, часть генов расмат-ривали как потенциальные гены-супрессоры и пытались выявить в них мутации, отличающие опухолевую ДНК от ДНК индивидов из контрольной группы.
Описанная стратегия в значительной степени отличается от современной, которая опирается на знание нуклеотидной последовательности практически всей хромосомной ДНК человека, значительной части его кДНК, функциональное описание генов и данные сравнительной геномики. Современные этапы поиска потенциальных генов-супрессоров, предшествующие анализу ДНК из опухолей, основаны главным образом не на получении новых экспериментальных данных, а на использовании электронных баз данных, и ключевыми методами стали методы биоинформатики. Однако окончательное подтверждение функционирования гена в качестве супрессора опухолевого роста всегда следует лишь из экспериментальной характеристики вариаций в ДНК опухолевых клеток.
Данный обзор описывает работы по геном-ориентированной стратегии поиска генов-супрес-соров на примере исследования области 13q14, которая часто утрачивается в клетках ряда опухолей, в частности при раке предстательной железы и В-клеточном хроническом лимфолейкозе (В-ХЛЛ) [4].
ПРЕДЫСТОРИЯ ТОНКОЙ ХАРАКТЕРИСТИКИ ОБЛАСТИ Щ14
ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА И ПОИСКА В НЕЙ ГЕНОВ-ОНКОСУПРЕССОРОВ
Изучение тонкой структуры области 13q14 генома человека, необходимое для установления роли этой области в развитии опухолей, проводилось нами в рамках проекта "Картирование и сек-венирование хромосомы 13" Российской национальной программы "Геном человека".
Основой для этого проекта послужили хромо-сомоспецифические клонотеки рекомбинантных космид, сконструированные в Лос-Аламосской национальной лаборатории (ЬАКЬ, США) и в Королевском фонде исследований рака (ГСЯТ, Великобритания). Эти клонотеки использовались не только для поиска опухолевых генов-супрессо-ров, но и в других исследованиях, проведенных в рамках проекта "Картирование и секвенирование хромосомы 13".
Индивидуальные клоны каждой клонотеки (всего около 30000 клонов, примерно 9 эквивалентов хромосомы 13) хранились в лунках иммунологических планшетов. Каждая клонотека была охарактеризована по представительности и
размеру вставок [5]. Охарактеризовано также число и полиморфизм генов рРНК из хромосомы 13 различного происхождения (совместно с лабораторией А.П. Рыскова, ИБГ РАН) [6, 7]. Как мы установили, в хромосомах, использованных для получения этих клонотек, число генов рРНК различалось более чем в 2 раза. Совместно с лабораторией Ю. Юрова (ВНЦПЗ РАМН) в этих клоно-теках обнаружены и охарактеризованы космиды, маркирующие область альфа-сателлитного повтора в хромосоме 13, но не в других хромосомах, содержащих этот повтор [8]. В настоящее время эти космиды используются в для цитогенетичес-кого анализа хромосомных перестроек. Нуклео-тидные последовательности тандемных блоков генов рРНК, а также альфа-сателлитов не представлены в существующих версиях всего генома человека [9, 10]. Поэтому данные о структуре этих участков генома, особенно о различиях этих участков, отражающих межхромосомную вариабельность, остаются уникальными. Еще один результат исследования космидных клонотек - создание и характеристика набора микросателлит-ных полиморфных маркеров. Эта работа проведена вместе с лабораториями В.В. Носикова (ГосНИИгенетика), А.В. Зеленина (ИМБ РАН) и В.М. Захарьева (ИМБ РАН) [11-15]. Полученные маркеры используются в работах по ДНК-идентификации личности. Изучение рекомбинантых космид позволило установить правильную экзон-интронную структуру гена-онкосупрессора ING1 [16]. Отметим также построение контига рекомбинантных космид длиной более 600 т.п.н., перекрывающего область хромосомы 13, часто деле-тируемую при В-ХЛЛ [17, 18]. Построение кос-мидного контига стало возможным после того, как из полученного ранее контига, перекрывающего исследуемую область, сформировали под-выборки клонов, гибридизующихся с YAC-клона-ми. Построение космидного контига сыграло важную роль в выявлении, картировании и изучении потенциальных генов-супрессоров, связанных с В-ХЛЛ.
ПОИСК МИНИМАЛЬНОГО УЧАСТКА
ГЕНОМА, УТРАЧИВАЕМОГО ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ В-КЛЕТОЧНОМ ЛИМФОЛЕЙКОЗЕ
Толчком к поиску гена-супрессора, вовлеченного в предотвращение В-ХЛЛ, послужило то, что ранее известный ген-супрессор RB1, локали-зованый в области 13q14, оказывался функциональным у части больных В-ХЛЛ, а делеции в опухолевых клетках таких больных были выявлены рядом с геном RB1 со стороны теломеры [19, 20]. Было высказано предположение, что в этой области генома должен находиться еще один ген-супрессор, критически важный для предотвращения развития В-ХЛЛ. Эта работа была вы-
полнена в Каролинском госпитале (Стокгольм, Швеция).
Расстояния между ближайшими маркерами для физического картирования в этом районе измерялись миллионами пар нуклеотидов, что не позволяло осуществить тонкое картирование концов различных делеций в ДНК из крови больных. Поэтому необходимо было насытить данный район генома маркерами, установить их расположение и расстояние между ними, т.е. провести физическое картирование. Были выявлены ¿ГС-маркеры, предположительно относящиеся к интересующему нас отрезку генома, и с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) проведен скрининг общегеномных YAC-клонотек, что позволило построить контиг YAC-клонов, принадлежащих данному району, и установить последовательность ¿ГС-маркеров [21]. В результате этой работы расстояния между маркерами сократились до размера YAC-клонов (200-1000 т.п.н.), т.е. на некоторых отрезках разрешение карты повысилось примерно на порядо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.