УДК 57.127;577.25;616.097;616-092.9
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ КАРТИРОВАНИЕ ВНЕКЛЕТОЧНОГО УЧАСТКА РЕЦЕПТОРА НЕЙРОТРОФИНОВ Р75
© 2015 г. Н. В. Бобкова1*, Н. И. Медвинская1, И. В. Нестерова1, А. Н. Самохин1, А. В. Камынина2, Д. О. Короев2, Т. Д. Волкова2, Я. В. Запорожская2, О. М. Вольпина2
Институт биофизики клетки РАН, 142290, Пущино, ул. Институтская, 3; *электронная почта: nbobkova@mail.ru 2Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,
117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Поступила в редакцию 05.01.2015 г.
Рецептор р75 — классический мембранный рецептор с внеклеточным участком, трансмембранным доменом и внутриклеточным С-концевым участком, содержащим домен смерти. Р75 опосредует активность нейротрофических факторов и играет существенную роль в регуляции важнейших функций клетки, начиная с пролиферации, дифференцировки, синаптогенеза, нейрональной пластичности и выживаемости до инициации апоптоза. Предполагается, что р75, находясь в комплексе с рецептором Тгк, усиливает позитивные эффекты нейротрофинов, однако в отсутствие Тгк-рецеп-торов взаимодействие р75 с нейротрофинами приводит к апоптозу клеток. В последнее время интерес к рецептору р75 значительно возрос, так как была установлена его возможная роль в генезе ней-родегенеративных заболеваний и, в частности, болезни Альцгеймера. При взаимодействии р75 с Р-амилоидом наблюдается гибель нейронов мозга. Поиск участков в структуре белка р75, связанных с развитием патологии, важен для понимания механизмов развития болезни Альцгеймера, а также создания мишень-опосредованных средств терапии этого заболевания. В настоящей работе с использованием иммунологических подходов проведено структурно-функциональное картирование внеклеточного домена рецептора р75 в условиях развития нейродегенеративного процесса альцгеймеровского типа у ольфакторно бульбэктомированных животных. На основе данных рент-геноструктурного анализа строения молекулы р75 были выбраны девять внеклеточных участков этого рецептора, предположительно несущих сайты связывания с Р-амилоидом и участвующих в развитии патологического процесса. Синтезированы пептиды с аминокислотной последовательностью, аналогичной последовательности выбранных участков. Иммунизация такими фрагментами, конъюгированными с гемоцианином, индуцировала образование противопептидных антител у экспериментальных животных, однако только иммунизация фрагментом 167—176 р75 препятствовала ухудшению памяти и гибели нейронов в коре и гиппокампе бульбэктомированных мышей, не влияя при этом на ложнооперированных животных. Полученные данные свидетельствуют о том, что фрагмент (167—176) р75 представляет интерес для дальнейших исследований и может стать основой для разработки иммунотерапии болезни Альцгеймера.
Ключевые слова: рецептор р75, болезнь Альцгеймера, синтетические пептиды, иммунизация, пространственная память, нейрональная плотность.
Б01: 10.7868/80233475515030044
ВВЕДЕНИЕ
Белок р75 — один из членов семейства рецепторов фактора некроза опухолей [1, 2]. Он опосредует активность нейротрофических факторов (МОБ) и играет существенную роль в регуляции важнейших функций клетки, начиная от пролиферации, дифференцировки, синаптогенеза, нейро-нальной пластичности и выживаемости до инициации апоптоза. Функциональная гетерогенность рецептора р75 обусловлена его способностью взаимодействовать с разными лигандами и форми-
ровать комплексы с другими рецепторами [3]. Наиболее хорошо изучено его взаимодействие с нейротрофинами N0^ ВЭМР, МТ-3 и МТ-4, которые с низкой аффинностью связываются с рецептором р75 и селективно с высокой аффинностью взаимодействуют с рецепторами тирозинки-наз (Тгк А, Тгк В и Тгк С) [2]. Связывание МОБ с Тгк-рецепторами сопровождается стимуляцией синаптогенеза и повышением выживаемости клеток. Результаты их взаимодействия с р75-ре-цептором не столь ясны. Предполагается, что, находясь в комплексе с Тгк-рецептором, р75 усили-
вает позитивные эффекты NGF, однако в отсутствие Trk-рецепторов взаимодействие р75 с NGF приводит к апоптозу клеток [4]. В последнее время значительно возрос интерес к рецептору p75, так как была установлена его возможная роль в генезе нейродегенеративных заболеваний и, в частности, болезни Альцгеймера (БА) [5, 6].
Белок p75 — классический мембранный рецептор. Его внеклеточный участок содержит четыре субдомена, обогащенных остатками цистеина, где, как предполагается, размещены сайты связывания с лигандами. Имеется также трансмембранный домен, связывание с которым регулирует внутримембранный протеолиз р75 [7]. Внутриклеточный С-концевой участок рецептора р75 содержит домен смерти [8]. Известно несколько различных механизмов участия р75 в гибели клетки: 1) увеличение числа рецепторов р75 и их ди-меризация на фоне снижения уровня Trk-рецеп-торов; 2) рост соотношения уровней пронейро-трофин/нейротрофин; 3) наличие сайта/сайтов связывания с ß-амилоидом (ßA), опосредующих его нейротоксическое действие на нейроны [9]. О присутствии сайта/сайтов связывания ßA в молекуле р75 свидетельствуют данные, согласно которым лиганды, взаимодействующие с внеклеточным доменом р75, способны блокировать токсическое действие ßA в тестах in vitro [10]. Однако точное место расположения сайта пока не установлено.
Один из подходов, позволяющих судить о возможности взаимодействия сложных белковых молекул, — рентгеноструктурный анализ их комплексов. Так, установлена димерная структура р75 и обнаружены два сайта связывания внеклеточного домена р75 рецептора с молекулой фактора роста нервов (NGF) [11—13]. В основу нашего подхода положено предположение о том, что сайты связывания рецепторов с различными ли-гандами находятся на их внеклеточных доменах и выработка антител к таким сайт-несущим фрагментам будет препятствовать их связыванию с лигандами. Ранее с использованием такого подхода мы выбрали фрагменты в структуре а7-ацетилхо-линового и прионного рецепторов, взаимодействующих с ßA, иммунизация которыми предотвращала развитие нейродегенеративного процесса альцгеймеровского типа (НАТ) [14, 15]. Важно отметить, что поиск сайтов связывания ßA с рецептором р75 целесообразно проводить только на животных моделях БA, в которых наблюдается повышенный уровень мозгового ßA, коррелирующий с гибелью нейронов. Этому требованию отвечают ольфакторно бульбэктомированные (ОБЭ) животные, которые проявляют основные признаки развития HAT, включая потерю пространственной памяти, повышенный уровень мозгового ßA и гибель нейронов в структурах мозга, ответственных за обучение и память, на фоне
дефицита ацетилхолинергической и серотони-нергической систем мозга [16, 17]. Есть основание полагать, что у этих животных повышен уровень рецептора р75, как это установлено у трансгенных животных — одной из моделей БA, и у больных БA [18], что должно облегчить анализ функциональной гетерогенности этого рецептора в условиях in vivo.
Таким образом, цель нашей работы состояла в структурно-функциональном картировании внеклеточного домена рецептора р75 и поиске участков в его структуре, имеющих отношение к развитию НЛГ у ОБЭ животных. Работу проводили в условиях in vivo с помощью выработки антител к синтетическим пептидам с аминокислотной последовательностью, аналогичной последовательности выбранных участков внеклеточного домена рецептора р75.
MATEРИAЛЫ И МЕТОДЫ
Для синтеза пептидов использовали реактивы и производные аминокислот фирм Merck (ФРГ) и Fluka (Швейцария). В иммунологических исследованиях применяли раствор гемоцианина улитки (KLH) в PBS в концентрации 5 мг/мл (Sigma_Aldrich, CШA), 25% водный раствор глу-тарового альдегида (Sigma, CШA), полный адъ-ювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда (Difco laboratories, СШA), козьи антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена (Имтек, Россия), 96-луноч-ные планшеты Maxisorp (Nunc, Дания).
Синтез пептидов проводили на и-алкоксибен-зильном полимере с содержанием гидроксильных групп 0.5 ммоль/г согласно Fmoc/Bu-схеме. Для оптимизации схемы синтеза в качестве С-конце-вой аминокислоты всех пептидов использовали остаток глицина. Fmoc-Gly-OH присоединяли методом симметричных ангидридов с избытком 5 экв. в присутствии 0.1 экв. 4-диметиламинопи-ридина. Наращивание пептидной цепи осуществляли последовательно. Временную Fmoc-защит-ную группу удаляли 20% раствором 4-метилпипе-ридина в DMF. Следующий Fmoc-защищенный аминокислотный остаток присоединяли TBTU-методом, используя смесь З экв. Fmoc-аминокис-лоты, З экв. TBTU и З экв. DIEA. Отщепление пептидов от твердофазного носителя с одновременным удалением защитных групп проводили в течение 2 ч, используя смесь 94.5% TFA, 2.5% воды, 2.5% 1,2-этандитиола, 1% триизопропилсила-на. Смесь отфильтровывали от полимера, упаривали, сырой продукт осаждали, добавляя сухой диэтиловый эфир, и сушили в токе воздуха. Пептиды очищали с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке Phenomenex Jupiter 10ц C18 300A 250 x 10 мм в градиенте ацетонитрила от 10 до 70% в 0.1% растворе TFA за З0 мин при расходе
элюента 3 мл/мин, поглощение элюата регистрировали при длине волны 226 нм. Растворы очищенных пептидов лиофилизировали. Аналитическую ВЭЖХ проводили на колонке Phenomenex Jupiter 5ц C18 300A 250 х 4.6 мм в градиенте ацетонитрила от 10 до 70% в 0.1% TFA за 60 мин при скорости потока элюента 1 мл/мин, поглощение элюата регистрировали при длине волны 226 нм. Синтетические пептиды охарактеризованы данными аминокислотного анализа, аналитической ВЭЖХ и масс-спектрометрии.
Получение конъюгатов пептидов с KLH и овальбумином. Для приготовления KLH-конъ-югатов пептидов к 1 мл раствора KLH в PB S (5 мг/мл, pH 7.4) добавляли 1 мг пептида, перемешивали в течение 30 мин. Затем по каплям добавляли 50 мкл 0.25% раствора глутарового альдегида, инкубировали в течение 16 ч и диализовали против PBS в течение 18 ч с трехкратной сменой буфера. Для приготовления конъюгата c овальбумином 1 мг пептида растворяли в 500 мкл PBS и добавляли 2 мг овальбумина. Затем по каплям добавляли 50 мкл раствора гидрохлорида М-(3-диметил-аминопропил)-№-этилкарбодии
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.