БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, ¡999, том 25, № 12, с. 883-891
Статья посвящена 40-летию Института биоорганической химии
УДК 577.152.34*215..3' 13
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ АТР-ЗАВИСИМОЙ Lon-ПРОТЕИНАЗЫ ИЗ Escherichia coli
©1999 г. Т. В. Ротанова#
Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117871, Москва, ГСП-7, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Поступила в редакцию 05.Ü4.99 г. Принята к печати 13.05.99 г.
Представлены данные о ферментативных свойствах и структурных особенностях АТР-зависимой Ьоп-протеиназы Escherichia coli и ее мутантных и модифицированных форм. Выявлены аминокислотные остатки, существенные для функционирования протеолитического и АТР-азного центров фермента и для передачи междоменного сигнала сопряжения активностей. Показано, что только полноразмерный фермент обладает способностью к гидролизу белковых субстратов, а изолированный протеолитический домен проявляет пептидгидролазную активность.
Ключевые слова: А TP-зависимый протеолиз; Ьоп-протеиназа; активный центр; сайт-направленный мутагенез; междоменные взаимодействия; Escherichia coli.
Внутриклеточная деградация белков - строго контролируемый процесс. В цитозоле, ядре и митохондриях эукариотических клеток и в цитоплазме бактериальных клеток этот процесс осуществляется главным образом высокоселективными мультимерными энергозависимыми протеиназами [1-4]. Протеолитическая активность этих ферментов сопряжена с гидролизом АТР, что выделяет их в особую группу протеиназ. В клетках Escherichia coli к настоящему времени обнаружено пять АТР-зависимых протеиназ [5]: Lon (La), FtsH (HflB), ClpAP (Ti), ClpXP и HslVU (ClpQY). Первые два фермента относятся к семейству AAA (ATPases Associated with a variety of cellular Activi-йез)-белков, их протеолитический и АТР-азный центры локализованы в одной полипептидной цепи, и они функционируют как гомоолигомеры. Остальные три фермента - представители семейства Clp (Chaperone-linked proteases)-npoTenHa3 и представляют собой гетсроолигомеры, состоящие из протеолитических (ClpP или HslV) и регу-ляторных АТР-азных (ClpA, ClpX или HslU) субъединиц. Lon [3, 6], ClpAP и ClpXP [7] - сериновые протеиназы; каталитически активным остатком HslVU является треонин [8], a FtsH охарактеризована как Zn-зависимая металлопротеиназа [9]. Несмотря на существенные успехи в исследовании АТР-зависимых протеиназ, природа селективности и механизм сопряжения АТР-азной и протеолитической активностей у этих ферментов до настоящего времени не выяснены.
Первой обнаруженной АТР-зависимой про-теиназой явилась Lon-протеиназа из Е. coli (КФ 3.4.21.53; далее - Lon-протеиназа, Lon) [10,
#Тел.: (095) 335-42-22; e-mail: rotanova@ibch.siobc.ras.ru.
11]. В дальнейшем стало ясно, что ферменты субсемейства Lon-протеиназ присутствуют в клетках самых различных организмов от прокариот до эукариот. В Е. coli Lon-протеиназа осуществляет селективную деградацию ряда корот-коживущих регуляторных белков, а также освобождает клетки от дефектных и мутантных белков [1^4].
Lon-протеиназа стала объектом нашего изучения в 1987 г. Общая задача исследования состояла в выявлении особенностей строения и функционирования фермента, которые отличают Lon-протеиназу от "классических" протеиназ и которые определяются сопряжением протеолиза и гидролиза АТР.
На начальных этапах работы нами был клонирован ген Ion Е. coli, определена его структура и выведена аминокислотная последовательность Lon-протеиназы (784 а.о.) (рис. 1 а) [12, 13]. Практически одновременно в литературе была опубликована структура Ion-гена и соответствующая первичная структура Lon-протеиназы, отличающаяся от предложенной нами в области остатков 264-317 и 539-563 [14]. Для выяснения истинной структуры Lon-протеиназы фермент был наработан в препаративных количествах (с помощью специально созданного штамма Е. coli. AB 1899/pBR/ö«) и подвергнут химической фрагментации по остаткам триптофана BNPS-скатолом [15]. Результаты определения /V-концевой последовательности полученных фрагментов молекулы фермента позволили сделать выбор в пользу структуры, установленной в нашей лаборатории.
Изучение активности Lon-протеиназы в отношении гидролиза ряда белковых и пептидных
(fl)
1 (6)
i 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781
MNPERSERIE DEPGVNDLFT TIDEREQEVL QSVLEMSDVN LGEMDDAPDE VPWNARTKVK GKTSLGQSIA LLDEIDKMSS LLDRMEVIRL VRGLEREISK LAWTEVGGDL KRDIHVHVPE EKLLAAHRGG VTAК
I PVbPLRDW VGTVASILQM VRTAISQFEG ERLEYLMAMM NEALKRKXDA KDLRQAQEIL KATGRKYVRM DMRGD PASAL SGYTEDEKLN LCRKAVKQLL LTIETACVPG GATPKDGPSA IKTVLIPFEN
VYPHMVIPLF LKLPDGTVKV YIKLNKKIPP ESEIDLLQVE AKMPKEAKEK DTDHYGLERV ALGGVRDEAE LEVbDPEQNV XAKRHLLPKQ LDKSLKHIEI KGKLTYTGSL GIAMCTALVS KRDLEEIPDN
VGREKSIRCL LVEGLQRARI EVLTSLKSID KRIRNRVKKQ AERELQKLKM KDRILEYLAV IRGHRRTYIG AFSDHYLEVD IERNALKKGE NGDNLHDYLG GEVMQESIQA CLTGNPVRAD VIADLDIHPV
EAAMDHDKKI SALSDNGEHF DPARIADTIA MEKSQREYYL MSPMSAEATV QSRVNKIKGP SMPGKLIQKM YDLSDVMFVA LTVDDSAIIG VQRFDYGRAD ALTWRARAE VAMTGEITLR KRIEEVLTLA
MLVAQKEAST SAKAEYLESP AHMPLKLADK NEQMKAIQKE VRGYIDWMVQ I LC.LVGPPGV AKVGVKNPLF TSNSMNIPAP IIRYYTREAG NENRVGQVTG KLGXNPDFYE GQVLPIGGLK LRNEPSGMQV
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780
|_j567 D609
г 679
A
784
GPPGVGKT 6 {мотив A)
LFLLD4Z (мотив В)
Рис. 1. Первичная структура 11 3] (а) и схема строения но данным работы [6] (6) полипептидной цепи Ьоп-протеиназы Е. coli. Показаны мотивы Уолкера А и В и отмечена локализация аминокислотных остатков, тестированных на принадлежность к протеолитическому центру; знаками "?" отмечены предполагаемые границы доменов.
субстратов привело к заключению о том, что фермент не обладает выраженной первичной специфичностью [ 15] и гид ¡хиппует белковые субстраты по процессивному механизму П. 3]. Данные по частичной инактивации Ьоп-протеиназы под действием дизопропилфторфосфата позволяли отнести фермент к семейству сериновых протеиназ [16], однако анализ первичной структуры показал отсутствие в молекуле фермента характерных для известных "классических" сериновых протеиназ консервативных фрагментов последовательностей, содержащих каталитически активные остатки серина, гистидина и аспарагиновой кислоты [17]. Вместе с тем в центральной части молекулы были обнаружены мотивы Уолкера А и В (рис. 16) - консервативные фрагменты последовательности, характерные для ряда АТР-связыва-ющих белков и АТР-аз, участвующие в связывании нуклеотида и иона магния [18]. В.К. Антоновым с сотр. была сформулирована концепция [6], согласно которой субъединица Ьоп-протеиназы состоит из трех последовательно соединенных функциональных доменов: /У-концевого (М-домен, около 330 а.о.), центрального, обладающего АТР-азной активностью (А-домен, около 200 а.о.) и С-концевого - протеолитического (Р-домен, около 250 а.о.) (рис. 16), при этом некоторые косвенные признаки свидетельствовали в пользу того, что каталитически активен остаток 8ег679 Р-до-мена [6, 13]. В это же время в литературе на роль каталитически активного был предложен другой остаток, а именно, БегЗбН [19], который в соответствии с вышеизложенной концепцией принадлежит А-домену. Выбор между этими двумя вари-
антами был сделан после получения мутантных форм Ьоп-протеиназы, в которых предполагаемые каталитически активные остатки серина (рис. 16) были заменены на аланин [15]. Оказалось, что у мутанта Lon-Ser368Ala сохраняется АТР-зависимая протеолитическая активность, а мутант Lon-Ser679Ala полностью ее утрачивает. Таким образом, было показано, что каталитически активным является остаток Ser679, то есть получено подтверждение справедливости предположения, что именно С-концевая часть молекулы Ьоп-протеиназы содержит протеолитический активный центр [15].
Исходя из представления о том. что каталитический центр сериновой протеиназы должен быть представлен "классической" триадой аминокислот - Ser, His, Asp - была предпринята попытка идентифицировать в Ьоп-протеиназе остальных участников триады. Поскольку на рассматриваемом этапе исследования была известна первичная структура единственного представителя подсемейства сериновых Ьоп-протеиназ -фермента из Е. coli, не включающего, как было отмечено выше, фрагментов последовательности, подобных консервативным участкам последовательностей известных сериновых протеиназ, в основу поиска был положен фактор удаленности от остатка Ser679 (вдоль полипептидной цепи) потенциальных каталитически активных остатков His и Asp. В молекулах ключевых ферментов известных подсемейств сериновых протеиназ каталитические триады представлены остатками Serl95, His57 и Aspl02 (химотрипсин, 243 а.о.) и Ser221, His64 и Asp32 (субтилизин, 275 а.о.) [17]
(а)
N N-A
GPPGVGKT(S) (мотив А)
ZZL(V)L(I)D (мотив В)
PKDGPSAG
566
S 8 « яМ
Е £ 8 м g
%% rwQ 784 Ё
А
(г)
(ö)
Рис, 2. Схемы строения Lon-протеииаз из различных источников: обобщенная (а), Lon-протеиназы Е. coli (б) и гибридных белков, использованных для получения Lon-протеиназы (в), ее двухдоменного фрагмента (г) и изолированного про-теолитического домена (()). N, А, Р - соответственно /V-концевой, АТР-азный и протеолитический домены, N-A и А Р -междоменные фрагменты, GST- глутатион-5-трансфераза, il-тромбинчувствительный линкер. Показаны локализация консервативных фрагментов (мотивов А,и В Уолкера и участка, включающего каталитически активный остаток серипа); аминокислотные остатки, подвергнутые сайт-направленному мутагенезу (о) и положение расщепляемой при автолизе связи (<)).
(следует заметить, что в обоих случаях активный остаток серина локализован в С-концевой части молекул ферментов, в то время как у Ьоп-проте-иназы 8ег679 занимает центральное положение в протеолитическом домене, рис. 16). По аналогии с химотрипсином в пределах протеолитического домена Ьоп-протеиназы потенциально активными остатками представлялись 1-Ия567 и Анр609. Однако было установлено, что эти остатки не принадлежат активному центру Ьоп-протеиназы, так как соответствующие мутантные формы фермента (Ьоп-№$567Туг и Ьоп-А.чр609А8п) сохраняют АТР-зависимую протеолитическую активность (Америк А.10., Ротанова
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.