БИОХИМИЯ, 2009, том 74, вып. 9, с. 1195 - 1203
УДК 547.96; 543.51,54,4
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ НОВОГО БИОРЕГУЛЯТОРА, ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ ТКАНИ ПИГМЕНТНОГО ЭПИТЕЛИЯ ГЛАЗА БЫКА***
© 2009 г. В.П. Ямскова1***, В.С. Скрипникова2, А.А. Молявка2, А.П. Ильина, М.С. Краснов1, Д.В. Маргасюк2, А.В. Борисенко2, Б.Б. Березин2, Е.С. Кузнецова3, А.К. Буряк3, И.А. Ямсков2
1 Учреждение РАН Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119334 Москва, ул. Вавилова, 26; факс: (499)135-8012, электронная почта: Yamskova-vp@yandex.ru
2 Учреждение РАН Институт элементоорганических соединений
им. А.Н. Несмеянова РАН, 119991 Москва, ул. Вавилова, 28; факс: (499)135-5037, электронная почта: Yamskov@mail.ru
3 Учреждение РАН Институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН, 119991 Москва, Ленинский просп., 31;
факс: (495)952-5308, электронная почта: tsiv@phyche.ac.ru
Поступила в редакцию 16.03.09 После доработки 21.04.09
Из ткани пигментного эпителия глаза быка выделен новый биорегулятор, действующий в сверхмалых дозах, которые соответствуют 10-17 мг белка в 1 мл. Установлено, что функциональной основой данного биорегулятора является комплекс низкомолекулярного регуляторного пептида (4,372 кДа) и модулятора белковой природы, который представлен смесью белков с молекулярными массами 14,980—66,283 кДа. Показано, что регуляторный пептид отвечает за проявление биорегулятором мембранотропной активности, а белки-модуляторы — за биологическое действие в сверхмалых дозах. Представлены данные, которые демонстрируют наличие взаимосвязи между наноразмерным состоянием биорегулятора и его способностью проявлять активность в сверхмалых дозах.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: биорегуляторы, регуляторные белки, наночастицы, сверхмалые дозы.
Поиск ранее не изученных эндогенных биологически активных веществ и выявление их структурных особенностей — актуальная задача современной биоорганической химии. К таким веществам относятся биорегуляторы белковой природы, которые были обнаружены в различных тканях животных и растений [1—14]. Их идентификация оказалась возможной благодаря разработке нового экспериментального подхода, включающего в себя оригинальную методику выделения (экстракции) биорегуляторов из тканей, в сочетании с классическими методиками очистки и новым методам биотестирования
Принятые сокращения: РБ — регуляторные белки, СМД — сверхмалые дозы, ТФ — трифторуксусная кислота, ПЭ — пигментный эпителий, АСМ — атомно-силовая микроскопия, РП — регуляторный пептид.
* Ускоренная публикация.
** Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 09-084, 09.08.2009.
*** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
[1—3]. Для исследования специфической активности биорегуляторов данной группы были созданы новые модели органотипического культивирования тканей in vitro [6—14]. Было установлено, что в сверхмалых дозах (СМД) биорегуляторы данной группы оказывают влияние на ход и направленность важнейших биологических процессов (миграция, адгезия, дифференциров-ка, пролиферация клеток), стимулируют восстановление и репарацию поврежденных тканей [1—3, 6—14]. Биорегуляторы проявляют сходные физико-химические свойства: в водных растворах они присутствуют в виде наночастиц (50—200 нм), в их состав входят низкомолекулярные белки (регуляторные белки (РБ)), их активность характеризуется резистентностью к воздействию различных физико-химических факторов [7—13]. Характерное свойство биорегуляторов данной группы — высокая кальций-связывающая активность [5].
Показано, что в различных тканях позвоночных животных присутствуют белки, модулирую-
щие активность РБ, которые были названы белками-модуляторами. Один из таких белков, модулирующий активность сывороточного РБ, был идентифицирован как представитель муль-тисемейства альбуминов сыворотки крови [15]. Взаимодействие между РБ и модулятором осуществляется по механизму лектин-углеводного узнавания, причем в роли лектина выступает белок-модулятор, который связывается с олиго-маннозидной компонентой РБ [15].
При исследовании тканей глаза млекопитающих было показано, что в них присутствуют биорегуляторы данной группы, активность которых характеризуется проявлением тканевой, но отсутствием видовой специфичности [5, 7]. Биорегуляторы тканей заднего отдела глаза (сетчатка, пигментный эпителий (ПЭ)) отличаются от выделенных из других тканей, в частности глаза (хрусталик, роговица, склера), высоким сродством РБ к модуляторам. Поэтому ранее исследования биорегуляторов, выделенных из сетчатки и ПЭ, были проведены на фракциях, содержащих комплексы РБ—модуляторы [5, 6]. В этих исследованиях было показано, что биорегулятор, выделенный из ПЭ, оказывает влияние на стабилизацию дифференцировки клеток ПЭ глаза взрослых тритонов, поддерживает жизнеспособность биполярных и мюллеровских клеток в условиях in vitro [6]. При этом биорегулятор, выделенный из нейральной сетчатки (ткани, имеющей с ПЭ общее происхождение и связанной с ним функционально), не действовал на состояние клеток ПЭ, а способствовал поддержанию жизнеспособности клеток мюллеровской глии in vitro [6].
Подобраны условия разделения комплекса РБ—модулятор и получены отдельные его компоненты, изучена биологическая активность фракций РБ, модулятора и комплекса РБ—модулятор, а также с помощью метода масс-спектро-метрии оценен состав компонентов комплекса, исследован биорегулятор, выделенный из ПЭ глаза.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Выделение и очистка биорегулятора. ПЭ препаративно отделяли от других тканей свежеэ-нуклеированных глаз молодых бычков (Таганский мясоперерабатывающий комбинат, Россия), помещали на 3 ч при 4° в экстрагирующий раствор состава 0,15 М МаС1, 1 мМ СаС12, 1 мМ Иере8. После центрифугирования тканевого экстракта при 3000 g в течение 30 мин надоса-дочную жидкость собирали и далее высаливали сухим серно-кислым аммонием (780 г/л) в при-
сутствии 10-2 М ЭДТА. Полученную суспензию белков центрифугировали при 105 000 g в течение 45 мин. После этого собирали три фракции (супернатант, флотирующая фракция, осадок), которые диализовали против воды до полного удаления ионов аммония, и определяли мембра-нотропную активность адгезиометрическим методом [3].
Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография. Для супернатанта ПЭ ее проводили на жидкостном хроматографе высокого давления 1100 Series («Agilent», США) с использованием колонки Биохиммак С8 (4,6 х 150 мм, 200 А). На колонку наносили 100 мкл исследуемого образца. В качестве элюента применяли смесь 0,1%-ная трифторуксусная кислота (ТФУ)— ацетонитрил, которую подавали на колонку в градиенте концентрации ацетонитрила от 5 до 80% со скоростью 0,5 мл/мин при 25°. Детекцию белковых фракций осуществляли при 210 и 280 нм.
Рехроматографию гидрофильной фракции ПЭ со временем удержания 3,1 мин проводили на колонке Luna С18 (2 х 150 мм, 100 А) («Phenomenex», США), предварительно уравновешенной в стартовом буфере (0,1%-ная ТФУ). Хроматографию осуществляли при скорости 0,3 мл/мин в градиенте концентрации ацетонитри-ла 0^-30% за 70 мин. Выход фракций определяли спектрофотометрически по оптическому поглощению при длинах волн 210 и 280 нм. Полученную фракцию со временем удержания 59,8 мин собирали, лиофилизовали, после чего проводили масс-спектрометрический анализ.
Обращенно-фазовую ВЭЖХ компонентов, полученных после электрофореза в ПААГ гидрофобной фракции со временем удержания 14,23 мин, проводили на колонке Jupiter С5 (2 х х 150 мм, 300 А) («Phenomenex»), предварительно уравновешенной стартовым буфером (0,1%-ная ТФУ). Хроматографию проводили при скорости 0,3 мл/мин с использованием линейного градиента ацетонитрила 0^-70% за 70 мин. Выход фракций определяли спектрофотометрически по оптическому поглощению при длинах волн 210 и 280 нм. Полученные фракции собирали, лиофилизовали, после чего проводили масс-спектрометрический анализ.
Na-Ds-Электрофорез. Его проводили методом Лэммли [16] в вертикальных пластинах ПААГ толщиной 0,75 мм с концентрациями акрилами-да 15% для разделяющего и 5% для концентрирующего гелей. Электрофорез проводили при постоянном токе 20—30 мА в течение 1 ч. После окончания электрофореза гель фиксировали и окрашивали кумасси^250. Из геля вырезали фрагменты, соответствующие белкам с молекулярными массами 67—70, 60—66, 30—35 кДа.
Применяли маркерные белки 14,4—94 кДа («Хе-ликон», Россия).
Метод аффинной хроматографии. С помощью этого метода изучали две фракции, полученные после обращенно-фазовой хроматографии су-пернатанта, выделенного из тканевого экстракта ПЭ. Данное исследование проводили по методике, разработанной ранее при изучении РБ и белка-модулятора, выделенных из сыворотки крови крупного рогатого скота [15]. Гидрофильную фракцию (4 мл) наносили рециркуляцион-но на колонку с сефарозой-4В, содержащую иммобилизованный конканавалин А (СопА-сефа-роза-4В), при 4° в течение 100 ч со скоростью
1—2 мл/мин. Сорбент промывали 0,15 М №С1 в течение 36 ч, а затем в течение 100 ч элюировали РБ путем рециркуляционной подачи раствора, содержавшего 1 М а-метил^-маннозид, 10 мМ СаС12, 0,1 мМ МпС12, 0,1 мМ азид натрия. Полученную таким образом фракцию собирали, диа-лизовали против раствора, содержавшего 10 мМ СаС12, и использовали для определения мембра-нотропной активности.
Гидрофобную фракцию (10 мл) наносили ре-циркуляционно на колонку с сефарозой-4В, содержавшую иммобилизованную маннозу (тап-сефароза-4В), при 4° в течение 100 ч со скоростью 1—2 мл/мин. Далее сорбент промывали 0,15 М №С1 в течение 36 ч и элюировали белок-модулятор путем рециркуляционной подачи раствора, содержавшего 1 М а-метил^-манно-зид, 10 мМ СаС12, 0,1 мМ МпС12, 0,1 мМ азида натрия, в течение 100 ч. Полученную фракцию белка собирали и диализовали против раствора, содержавшего 10 мМ СаС12, а после этого определяли ее мембранотропную активность.
MALDI-TOF-Спектрометрия. Анализ молекулярной массы белков проводили методом MALDI-TOF на времяпролетном масс-спектрометре U1traF1ex 2 («Вгикег Da1tonic», Германия). Времяпролетные масс-спектры фиксировали в лин
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.