БИОФИЗИКА, 2013, том 58, вып. 4, с. 635-644
МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА :
УДК 577.325:577.15
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ИНУЛИНАЗ. ПУТИ РЕГУЛИРОВАНИЯ ИX АКТИВНОСТИ
© 2013 г. В.Г. Артюхов, М.Г. Холявка, Т.А. Ковалева
ФГБОУ ВПО «Воронеж ский государственный университет», 394006, Воронеж, Университетская пл., 1
E-mail: holyavka@rambler.ru Поступила в p едакцию 26.06.12 г. После последней доработки 25.03.13 г.
Обзор посвящен анализу структурно-функциональных особенностей инулиназ из различных продуцентов. Особое внимание уделено вопросам молекулярной и надмолекулярной организации ферментов, описанию их функциональных свойств в зависимости от структурного состояния и в условиях различного микроокружения. C биофизических позиций обсуждены перспективы развития биотехнологических процессов с использованием свободных и иммобилизованных инулиназ.
Ключевые слова: инулиназа, структурно-функциональные свойства, микроокружение.
Инулиназы (инулазы, 2,1-Р-В-фруктан-фруктаногидролазы, КФ 3.2.1.7) расщепляют инулин и фруктоолигосахариды до фруктозы. Изучение структурно-функциональных свойств инулиназ в условиях р азличного микроокружения имеет большое теор етическое и прикладное значение. Эти ферменты участвуют в углеводном метаболизме высших растений и микроорганизмов, являются важнейшими компонентами сигнальных путей системы коммуникации, играют одну из ключевых ролей в контролировании процессов клеточной дифференцировки, роста и развития указанных организмов. Они также могут быть использованы в циклах про -изводства сахаров с р азличной степенью полимеризации, в частности фруктозы и инулооли-госахаридов - неотъемлемых компонентов функционального питания, снижающих риск возникновения сахарного диабета, кариеса и ожирения. В настоящее время в литературе встречается небольшое количество работ, обобщающих результаты исследований, посвященных названной проблеме, а биофизические и биохимические основы функционирования ину-линаз практически не анализировались.
А втор ы работы [1] посвятили свою статью рассмотрению микроорганизмов, продуцирующих инулиназу, субстратов, способствующих интенсификации ее биосинтеза, ферментационных технологий, способов очистки, свойств ину-линаз, путей применения данных ферментных препаратов в промышленности. В работе [2] описан ряд новых микроорганизмов, экспрес-сирующих инулиназу, и охарактеризованы ге-
ны, кодирующие ее [1,2]. Однако эти исследователи не уделили должного внимания рассмотрению структурных особенностей инулиназ. Общепризнано, что каталитическая активность фер ментов определяется степенью мобильности белковой молекулы, даже при небольших изменениях конформации полипептидной цепи у энзимов способность к катализу резко изменяется. В связи с этим целью нашей работы был анализ результатов исследований ряда авторов относительно структурных особенностей инулиназ, выделенных из различных продуцентов, описание функциональных свойств этих ферментов в условиях различного микроокружения, обсуждение перспектив развития биотехнологических процессов с использованием инулиназ в свободном и иммобилизованном состояниях.
СТРУКТУРНЫЕ О СОБЕННОС ТИ МОЛЕКУЛ ИНУЛИНАЗ
Молекуляр ные массы инулиназ колеблются в пределах от 28 до 450 кДа (табл. 1). Из дрожжей Kluyveromyces species Y-85 выделены три формы инулиназы с молекулярными массами 42, 65 и 57 кДа. Из Kluyveromyces marxianus var. bulgar^us ATCC16045 получена инулиназа, молекулярная масса которой, по данным гель-фильтр ации, составляла 77 кДа, а по результатам SDS-PAGE-электрофореза - 57 кДа. Показано, что энзим из Kluyveromyces marxianus DSM 70106 является димером с молекулярной массой 200 кДа [3-5].
Таблица 1. Молекулярные массы инулиназ
Молекулярная масса, кДа
Пpоgуцент Определена методом гель-хроматографии Определена методом SDS-PAGE-электрофореза Метод не указан Источник литературы
Cryptococcus aureus G7a 60 [20]
Kluyveromyces species Y-85 EI EII Eexo 42 65 57 [4]
Kluyveromyces fragilis 64 [21]
Kluyveromyces fragilis 250 [22]
Kluyveromyces marxianus 72 [23]
Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus ATCC16045 77 57 [3]
Kluyveromyces marxianus DSM 70106 200 [5]
165-180 450 87-102
Kluyveromyces marxianus CBP 6556 72 64*** [6]
Kluyveromyces marxianus Y-303 63 54,8 и 8,4 Наши данные: [24]
Pichia guilliermondii 50 [25]
Pichia pastoris X-33 1 60 58** [26]
Alternaria alternata 115 [27]
A spergillus species 53 [28]
A spergillus species 81 [29]
A spergillus awamori 87,7 76,9 и 10,1 Наши данные: [76]
Aspergillus awamori var. 2250 69, 63*** [12]
A spergillus candidus 54 [30]
A spergillus ficuum 64 66 54,8*** [18]
A spergillus ficuum ExoI ExoII ExoIII ExoIV ExoV EndoI EndoII EndoIII 75 76 74 74 74 64 64 64 76 74 74 66 64 66 [31]
A spergillus fumigatus 200 66 62,7 59,4 176 5***** [8]
A spergillus niger 50 89 57**** [32]
A spergillus niger 315 85 [19]
A spergillus niger 12 81 57,3** [33]
Aspergillus niger 319 28 [13]
Окончание
Aspergillus niger M89
EI 102,6
EII 97,9 [34]
EIII 62,5
EIV 36,5
A spergillus versicolor 230 [35]
Fusarium oxysporum 300 [36]
83
Penicillium species 66 [17]
63
Penicillium species TN-88
энgоннуflнназа 81 68 [37]
экзоннуflнназа [38]
48
Penicillium janczewskii 66 [39,40]
80
Pseudomonas mucidolens 55 [41]
Rhizopus species strain TN-96 83 [42]
Arthrobacter species H65-7 100 49 [59]
Arthrobacter species S37 75 [43]
Arthrobacter Bu0141 45 [44]
Arthrobacter globiformis C11-1 50 45 [10]
Arthrobacter ilicis OKU17B 50 27 [9]
A rthrobacter ureafaciens 50 67 [45]
Bacillus polymyxa 90 [46]
Bacillus polymyxa MGL21 55,5** [47]
Bacillus smithii T7 47 [48]
Bifidobacterium infantis ATCC 15697 70 [49]
Crysosporium pannorum 56 58***** [50]
Crysosporium pannorum 70; 84 [16]
Escherichia coli1 57 [32]
Escherichia coli1 58 57,7 [47]
Escherichia coli HB1011 54 54 [51]
Escherichia coli/pMSiftOptR1 46 [11]
Escherichia coli/pMSiftOptWT1 46 54 56,7** [11]
Geobacillus stearothermophilus KP 1289 [51]
Cichorium intybus 1-FEH I 60,5-72 [52]
Cichorium intybus (1-FEH II) 64 [53,54]
Cichorium intybus L. (1-FEH w1, w2) 70 [55]
Helianthus tuberosus 1-FEH 75 [56, 57]
П римечания. * - В данный организм инулиназа была экспрессирована; ** - молекулярные массы рассчитаны исходя из первичной структуры; *** - после дегликозилирования; **** - молекулярная масса определена методом масс-спек-трометрии (МАЬБ1-ТОБ МБ); ***** - молекулярная масса определена методом неденатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле.
Две формы инулиназы из Kluyveromyces marxianus СВР 6556 при использовании метода БОБ-РАвЕ-электр офореза давали полидисперсную полосу между 87 и 102 кДа из-за различной
степени гликозилирования. После обработки эндо-Р-К-ацетилглюкозоаминидазой (КФ 3.2.1.96), отщепляющей углеводные участки от белковой глобулы, молекулярная масса энзимов со стави-
А РТЮХОВ и др. Таблица 2. Размеры (нм) и молекулярные массы (кДа) инулиназ
Продуцент Нативная молекула Субъединицы
R, нм* нм** кДа R, нм* нм** кДа R, нм* нм** кДа
Kluyveromyces marxianus Aspergillus niger 6,1 ± 0,2 12,6 ± 2,4 9,2 ± 1,4 6,4 ± 1,1 63 ± 2 102 ± 4 5,2 ± 0,3 5,1 ± 1,1 4,2 ± 0,8 3,4 ± 0,2 55 ± 3 62 ± 3 1,0 ± 0,1 1,7 ± 0,4 2,9 ± 0,3 2,2 ± 0,1 8 ±3 37 ± 4
П римечание. * - Радиусы молекул, определенные методом динамического светорассеяния на приборе Photocor complex; ** - высоты молекул, определенные методом атомно-силовой микроскопии на приборе SOLVER P47PRO.
ла 72 кДа. Таким образом, авторами было установлено, что экзоинулиназа из Kluyveromyces шагх1аиш СВР 6556 является димером с молекулярной массой от 165 до 180 кДа, а фермент, связанный с клеточной стенкой - тетрамером с молекулярной массой от 335 до 450 кДа. В качестве одной субъединицы в обоих случаях выступает полипептид массой 64 кДа и степенью гликозилирования от 26 до 37%. Обе формы инулиназы были стабильными и не переходили друг в друга без внешних воздействий. Интересно, что по отношению к инулину димер проявлял более высокую активность, чем тетрамер [6].
Для инулиназ из Aspergillus ататоп ВКМБ-2250 и АпНгоЬааег 8рес1е8 Б37 также зафиксировано влияние процесса олигомеризации на способность энзима расщеплять инулин: мономер ная форма белка обладала меньшей способностью к ферментативному катализу, чем димер (наши данные, [7]).
Для инулиназы из Aspergillus fumigatus мо-лекуляр ная масса, определенная методом гель-фильтрации, составляет 200 кДа, а методом электрофореза - 176,5 кДа. При применении БОБ-РАвЕ-электрофореза были получены полосы белка, соответствующие 66,0; 62,7 и 59,4 кДа, что свидетельствует об олигомерной структуре энзима [8].
Молекулярная масса инулиназы из Arth.ro-Ьacter gloЬiformis С11-1, определенная методом БОБ-РАвЕ-электрофореза, составляет 45 кДа, методом гель-фильтрации - 50 кДа. Энзимы из ArthroЬacter 8рес1е8 Н65-7 и ArthroЬacter Шш ОКИ17В являются димерами с молекулярными массами всей глобулы соответственно 100 и 50 кДа (установлены методом гель-фильтрации) и молекулярными массами одной субъединицы 49 и 27 кДа (опр еделены методом ЗББ-РАОЕ-электрофореза) [9-11].
Итак, в литературе имеются противоречивые данные относительно надмолекулярной организации инулиназ. Это характер но не только для ферментов, полученных из различных видов одного рода (в качестве примера могут послужить роды Kluyveromyces, Aspergillus и Arthro-
Ьacter), но даже для энзимов, выделенных из штаммов одного и того же вида микроорганизмов. Одни авторы утверждают, что инули-наза представлена только в мономерной форме, другие показывают наличие четвертичной структуры в виде димера или даже тетрамера.
Путем сочетания атомно-силовой микроскопии с методами динамического светорассеяния, гель-хроматографии и электрофореза нами были опр еделены размеры и молекулярные массы инулиназ из Kluyveromyces marxianus и Asper-gillus niger (табл. 2).
Для разрушения четвертичной структуры фер ментов мы использовали раствор додецил-сульфата натрия в концентрации 3
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.