ЖУРНАЛ ФИЗИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2007, том 81, № 7, с. 1329-1333
БИОФИЗИЧЕСКАЯ ХИМИЯ =
УДК 541.64:532.77
СТРУКТУРНО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НАНОЧАСТИЦ СЕЛЕНА, СТАБИЛИЗИРОВАННЫХ БЫЧЬИМ СЫВОРОТОЧНЫМ АЛЬБУМИНОМ
© 2007 г. С. В. Валуева*, Л. Н. Боровикова*, В. В. Коренева**, Я. И. Иазаркина*,
А. И. Киппер*,
Российская академия наук *Институт высокомолекулярных соединений, Санкт-Петербург **Институт цитологии, Санкт-Петербург E-mail: kipper@imc.macro.ru Поступила в редакцию 29.05.2006 г.
Методами статического и динамического рассеяния света, двойного лучепреломления в потоке изучены наноструктуры, образующиеся в результате восстановления ионного селена в редокс-системе селенит-аскорбат в водном растворе бычьего сывороточного альбумина (БСА). Установлено, что в ходе этого процесса образуются агрегативно устойчивые наночастицы селена, на которых происходит адсорбция молекул БСА. Отмечено, что при этом формируются высокоупорядоченные сверхвысокомолекулярные сферические наноструктуры, характеризующиеся значительной плотностью и уникальной морфологией. На клеточной культуре промиелоцитарной лейкемии HL-60 показано, что адсорбаты БСА на наночастицах селена способны подавлять рост опухолевых клеток и дезактивировать свободные радикалы с эффективностью, практически не уступающей селениту натрия.
В. В. Копейкин*
Выяснение исключительно важной роли селена для здоровья человека [1] послужило толчком для разработки профилактических и лечебных средств на основе неорганических и органических соединений селена. Грань между жизненной необходимостью, терапевтическими и токсическими дозами таких форм селена чрезвычайно мала. Токсичность селена снижается при переходе от его ионных форм к органическим соединениям селена, и особенно к селену в нулевой степени окисления. Оценка специфической биологической активности наночастиц нульвалентного селена, получаемого химическим восстановлением его ионных форм без использования стабилизаторов [2], а также биотехнологическими методами с использованием бактерий, аккумулирующих и восстанавливающих ионный селен [3], показала, что уровень их активности не превышает 2% от уровня активности широко применяемого в медицине селенита натрия. Однако недавно установлено [4], что при добавлении бычьего сывороточного альбумина к редокс-системе селенита натрия и глютатиона образуется красный аморфный наноселен (а-нано^°), который в 7 раз менее токсичен, чем селенит натрия, и сохраняет профиль и уровень биологической активности селенита натрия. При этом было высказано предположение, что селен связан с альбумином за счет относительно слабых нековалентных взаимодействий, природа которых авторами не устанавли-
валась [4]. Оценка биологической активности ре-суспензированного после центрифугирования осадка селена показала [4], что селен в отсутствие альбумина не проявляет биологической активности, характерной для селен-альбуминового композита.
Целью данной работы является синтез наночастиц нуль-валентного селена путем восстановления селенистой кислоты аскорбиновой кислотой в присутствии глобулярного белка БСА, обсуждение природы его взаимодействий с наночасти-цами и установление морфологии образующихся наноструктур БСА-Se0 в водных растворах, а также оценка потенциальной противоопухолевой и антиоксидантной активности этих нанокомпози-тов in vitro в сравнении с селенитом натрия.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовали селенистую и аскорбиновую кислоты с содержанием основного вещества не менее 99.99%. БСА (Calbiochem, fraction V, B grade) дополнительно очищали гель-фильтрацией на сефадексе G-100 (элюент - дистиллированная вода).
Реакцию восстановления ионного селена проводили при концентрации селена в водном растворе 0.01% и массовом соотношении Se : БСА v = 0.1, что соответствовало условию полного на-
сыщения адсорбционной емкости наночастиц для системы поливинилпирролидон-селен-вода [5].
Кинетические измерения проводили при температуре 20°С и рН 3.5 на спектрофотометре Specord M 40. Изменение оптической плотности раствора в ходе восстановления селенистой кислоты регистрировали при длине волны 320 нм.
Методом статического рассеяния света [6] определяли ММ (молекулярные массы, для
БСА -Мм,, для нанострукуры - М*) и среднеквадратичные радиусы инерции Я* наноструктуры, a также ее сродство к растворителю - воде (по величине второго вириального коэффициента А* ). По соотношению величин MМ для БСА и образуемой им наноструктуры определяли количество адсорбированных макромолекул (Ы*) на поверхности наночастиц Se. Для измерения приведенной интенсивности рассеяния растворов Я0 использовали фотогониодиффузометр "Fica". Длина волны падающего вертикально поляризованного света составляла 546.1 нм. Измерения проводили для углов рассеяния в интервале 0 = 30-150°. Значение инкремента показателя преломления ёп/ёсБСА (сБСА - концентрация БСА) получали из рефрактометрических измерений на приборе ИРФ-23.
Обработку экспериментальных данных светорассеяния для растворов нанокомпозитов осуществляли по методу Зимма путем двойной экстраполяции (к сБСА = 0, 0 = 0) графиков зависимости КсБСА/Я0 от sin2(0/2) + ксБСА (К - калибровочная константа, к - численная константа).
Методом динамического светорассеяния [7] определяли средний гидродинамический размер
наноструктуры Я* = 50 нм при сБСА —- 0. По соотношению экспериментальных величин Я* и Як
средней плотности сферической наноструктуры по формуле
определяли значение параметра р* = Я* /R* , характеризующего конформацию наноструктуры [8].
Оптическая часть установки для измерения динамического рассеяния света была укомплектована гониометром ALV-SP (Германия) (источник света - гелий-неоновый (He-Ne) лазер Spectra-Physics с длиной волны X = 632.8 нм, мощностью ~20 мВ). Корреляционную функцию интенсивности рассеянного света получали с помощью коррелятора Photo Cor-FC с числом каналов 288 (изготовитель - ЗАО "Антекс", Россия). Анализ корреляционной функции осуществляли с помощью программы обработки данных динамического светорассеяния Dynals (фирма "Гелиос", Россия).
На основании данных по M* и среднеквадратичному радиусу инерции определяли величину
ф* = 3M* /4nNaЯ
сф '
(1)
где Rcp = 1.29R* [9].
Методом двойного лучепреломления в потоке (ДЛП) [6] по характеру градиентной зависимости величины ДЛП An оценивали молекулярную дисперсность растворов образующихся наноструктур. При этом величину ДлП An определяли в зависимости от градиента скорости вращения ротора (g) и концентрации (с) БСА. Использовали титановый динамооптиметр с внутренним ротором высотой 4 см и величиной зазора между ротором и статором 0.03 см. Все исследования ДЛП проводили при термостатировании растворов (2l°C) во избежание изменений их вязкости и оптических искажений, вызываемых температурным градиентом. Для градуировки установки применяли фенилэтиловый спирт, который обладает значительным ДЛП (An/g = 1.7 х 10-11), а также систему полистирол-бромоформ. Погрешность определения характеристической величины ДЛП [n] = = lim (An /?сБСАп0) (где п0 - вязкость раство-
g ^ 0, c ^ 0
рителя) не превышала 10%. Измерения проводили при g < gk, где gk - градиент скорости, при котором наступает турбулентность потока.
Экспериментальная величина [n] в общем случае dn/dc Ф 0 (dn/dc - инкремент показателя преломления раствора, который для системы БСА-Se0-H2O составил 0.146) складывается из трех эффектов: [n] = [n]e + [nf + [nf, где [n]e - собственная анизотропия, [nf - эффект микроформы, [n]f - эффект макроформы [6]. Величина [nf связана с асимметрией формы частицы p соотношением:
* и R* [n]f = ((n2 + 2)/3)2(M*(dn/dc)2fp))/30nRTns =
= const XM*(dn/dc) f (p),
(2)
где ns - показатель преломления растворителя, T - абсолютная температура, R - универсальная газовая постоянная, ftp) - табулированная функция отношения осей жесткого эллипсоида, аппроксимирующего частицу [6].
Для биологического тестирования использовали клетки промиелоцитарной лейкемии линии HL-60 из банка клеточных культур Института цитологии РАН. Клетки культивировали в инкубаторе (5% С02, 37°С) на пластиковых чашках Петри в среде RPMI (Биолот, С.-Петербург) с добавлением 15% эмбриональной сыворотки крови крупного рогатого скота (Gibco). Для исключения микробной обсемененности культуральной среды использовали антибиотик гентамицин в концентрации 80 мкг/мл. Клетки предварительно
3
Таблица 1. Константа скорости реакции первого порядка по селенистой кислоте в присутствии БСА и структурно-морфологические характеристики селенсодержащих наноструктур на основе БСА
к* х 103, c-1 Mw х 10-6 N* R*, нм R* , нм р* A* х 104, см3 моль/г2 p Ф*, г/см3
2.5 70 1000 50 50 1.0 0.2 1.2 0.1
рассеивали в пластиковые чашки с диаметром 35 мм или в 24-луночные планшеты.
Обработку клеток HL-60 проводили через 1 сутки после пересева, добавляя соответствующие агенты в среду культивирования на определенные промежутки времени (от 1 до 3 суток).
Распределение клеток по содержанию ДНК изучали методом проточной цитофлюориметрии. Для увеличения проницаемости мембран, клетки обрабатывали тритоном X-100 в конечной концентрации 0.01% в течение 0.5 ч при температуре ~20°C, затем добавляли йодид пропидия (10 мкг/мл, Sigma, США), инкубировали 15 мин при 37°С и анализировали на проточном цитофлюориметре АТС 300 (Brucker) при скорости потока 20 мкл/мин в течение 3 мин.
Для определения уровня активных форм кислорода (АФК) в клетках в среду культивирования добавляли дигидроэтидиум бромид в конечной концентрации 5 мкМ за 30 мин до анализа. Клетки дважды промывали раствором PBS (20 мМ фосфатный буфер, рН 7.4; 0.1 М NaCl). Флюоресценцию бромистого этидия анализировали на проточном цитофлуориметре АТС 300 (Brucker).
Стимуляцию продукции активных форм кислорода в клетках осуществляли адриамицином в концентрации 10 нг/мл.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
При кинетическом изучении восстановления ионного селена установлено, что константа скорости реакции первого порядка к* по селенистой кислоте в присутствии БСА составляет 2.5 х 10-3 с-1 (табл. 1) , а в отсутствие белка 1.7 х 10-3 с-1. Таким образом
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.