БИОХИМИЯ, 2006, том 71, вып. 6, с. 798 - 807
УДК 581.143:577.114
СТРУКТУРНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ АРАБИНОГАЛАКТАНА И ПЕКТИНА ИЗ КАЛЛУСА Silene vulgaris (M.) G.
© 2006 г. О.А. Бушнева1, Р.Г. Оводова1, А.С. Шашков2, А.О. Чижов2, Е.А. Гюнтер1, Ю.С. Оводов1*
1 Институт физиологии Коми НЦ УрО РАН, 167982 Сыктывкар, Первомайская, 50; факс: (8-212)241-001, электронная почта: ovoys@physiol.komisc.ru 2 Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН, 119991 Москва, Ленинский пр., 47; факс: (495)135-5328, электронная почта: shash@ioc.ac.ru
Поступила в редакцию 12.08.05 После доработки 21.11.05
Из каллуса смолевки обыкновенной Silene vulgaris (M.) G. выделены и охарактеризованы арабиногалактан и пектин, названный нами силенаном. В результате фракционирования на DEAE-целлюлозе и ферментативного гидролиза с помощью пектиназы показано, что силенан из каллуса (содержание D-галактуроновой кислоты 80%) и из интактного растения S. vulgaris близки по структуре и свойствам: оба пектина отличаются высоким содержанием участков линейного а-1,4^-галактуронана. Согласно результатам ЯМР-спект-роскопии и анализа методом метилирования исходного очищенного полисахарида и его фрагмента, полученного с помощью периодатного окисления (распад по Смиту), углеводная цепь арабиногалактана состоит из различных участков ß-1,3-D-галактопиранана, связанных между собой многочисленными остатками 3,6-ди-О-замещенной галактопиранозы. Боковые цепи содержат остатки терминальной и ß-3-О-замещен-ной галактопиранозы, терминальной а-арабинофуранозы и а-рамнопиранозы, а-2-О-замещенной рамно-пиранозы. Показано, что остатки а-рамнопиранозы в углеводной цепи замещены по второму положению остатками 4-О-замещенной ß-D-галактопиранозилуроновой кислоты.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: арабиногалактаны, пектины, Silene vulgaris, ЯМР полисахаридов, метод метилирования, хромато-масс-спектрометрия метилированных сахаров, клеточные культуры.
Арабиногалактаны широко распространены в растительном мире. Они содержатся в клеточной оболочке как в свободном состоянии [1, 2], так и в составе других полисахаридов: камедей, пектиновых веществ, гемицеллюлоз [2, 3]. Известно, что в пектинах арабиногалактаны, а также галактаны и арабинаны, присутствуют в виде боковых цепей [2, 4]. Предполагается, что они являются источником биосинтеза разветвлен-
Принятые сокращения: AG-С — сырой арабиногалактан из каллуса S. vulgaris; AG-C-1, AG-C-2 — фракции, полученные с помощью гельпроникающей хроматографии сырого арабиногалактана AG-С; AG (AG-C-2-100) — очищенный арабиногалактан из каллуса S. vulgaris; AG-S — фрагмент, полученный в результате распада по Смиту арабиногалактана AG; SV — силенан, пектин из S. vulgaris; SV-P — фрагмент силенана SV устойчивый к ферментативной обработке пектиназой; SVC — силенан, пектин из каллуса S. vulgaris; SVC-P — фрагмент силенана SVC устойчивый к ферментативной обработке пектиназой; м.д. — миллионные доли.
* Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
ной области пектинов: присоединяясь к главной цепи макромолекулы — галактуронану — в процессе биосинтеза растительной клетки, они влияют на структуру пектинов.
Для изучения структуры и биосинтеза полисахаридов в качестве легко доступной модели часто используются полисахариды культур клеток растений [4]. Предполагается, что полисахариды, выделенные из клеточных стенок культивируемых in vitro клеток, представлены теми же полисахаридами, которые обнаружены в интакт-ных растениях [5, 6]. Каллусные культуры высокопродуктивны по биомассе и синтезируемым полисахаридам и отличаются от интактных растений однотипностью, представляя собой гомогенную систему, состоящую в основном из клеток с первичными клеточными стенками [7].
Известно, что полисахариды из каллусных культур, подобно полисахаридам из интактных растений, обладают иммуномодулирующей активностью [2]. Клеточные культуры могут служить удобной модельной системой для выявле-
ния зависимости физиологической активности от структурной организации макромолекулы растительных полисахаридов. С их помощью возможно получение физиологически активных полисахаридов с определенной структурой и заданными свойствами.
Ранее нами были разработаны оптимальные условия роста каллуса Silene vulgaris (Moench) Garcke (по другой классификации Oberna behen (L.) Ikonn) семейства Caryophyllaceae (гвоздичные) и биосинтеза полисахаридов [8]. Выделены арабиногалактан и пектин из каллусной культуры данного растения [9]. Изучены качественные и количественные изменения полисахаридов в течение ростового цикла каллусной культуры смолевки, а также влияние фитогормонов и углеводов на рост клеток и продуцирование полисахаридов [10, 11].
Данная работа посвящена установлению структуры арабиногалактана AG, продуцируемого каллусом S. vulgaris, и сравнительному изучению пектиновых полисахаридов из каллуса (SVC) и интактного растения (SV).
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Общие аналитические методы. Содержание гликуроновых кислот определяли по реакции с 3,5-диметилфенолом в присутствии концентрированной H2SO4 [12] (калибровочный график построен для D-галактуроновой кислоты); содержание белка — по методу Лоури [13] (калибровочный график для БСА); содержание меток-сильных групп — по методу [14] (калибровочный график для метанола). Все спектрофотометри-ческие измерения проводили на приборе Ultrospec 3000 (Англия). Удельное оптическое вращение определяли на поляриметре Polartronic MHZ (Германия).
Качественное и количественное определение нейтральных моносахаридов в виде соответствующих ацетатов полиолов проводили с помощью газожидкостной хроматографии (ГЖХ) на хроматографе Hewlett-Packard 4890A (США) с пламенно-ионизационным детектором и интегратором HP 3395А на капиллярной колонке RTX-1 (диаметр 0,25 мм х 30 м, «Restek», США), газ-носитель — аргон, температурная программа: от 175° (1 мин) до 250° (2 мин) со скоростью 3°/мин. Процентное содержание моносахаридов от суммарного препарата вычисляли из площадей пиков, используя коэффициенты отклика детектора [1].
Хромато-масс-спектрометрию (ГЖХ-МС) частично метилированных ацетатов полиолов проводили, используя для ГЖХ хроматограф
Varian 3300 (США) на капиллярной колонке DB-5 (диаметр 0,25 мм х 30 м, J2W Scientific), газ-носитель — гелий, в градиенте температур 150—280° со скоростью 5°/мин. МС: ионная ловушка Finnigan MAT ITD-700 (Англия), развертка от m/z 44 до m/z 500. Энергия ионизирующих электронов ~70 eV. Температура интерфейса 220°, частота сканирования 1 скан/с, задержка накопления 250 сек.
Спектры ЯМР снимали на приборе DRX-500 фирмы «Bruker» (Германия) для 3-5%-ных растворов олиго- и полисахаридов в D2O при 303° К (внутренний стандарт — ацетон, 8н 2,225 м.д., 8с 31,45 м.д.). Отнесение сигналов в спектрах ЯМР производили на основании данных двумерных (2D) экспериментов (COSY, TOCSY, ROESY и 1Н-, 13C-HSQC, HMQC/TOCSY), как описано ранее [15—18]. Для проведения 2D экспериментов использовали стандартные методики фирмы «Bruker». Эксперименты ROESY выполняли со временем смешивания 200 мсек. Для экспериментов TOCSY использовали длительность MLEV17 спин-лока 60 мсек. Положения замещения и последовательность моносахаридных остатков устанавливали с помощью 2D экспериментов по определению ядерных эффектов Оверхаузера (ROESY).
Гельпроникающую и ионообменную хроматографию выполняли на хроматографической системе («Pharmacia», Швеция). Выход углеводов контролировали по реакции аликвоты элю-ата с фенолом в присутствии концентрированной H2SO4 [19].
Все водные растворы концентрировали в вакууме на роторном испарителе при 40—45°, центрифугировали при 7000—8000 g в течение 10—20 мин, образцы подвергали лиофильной сушке.
Экстракция полисахаридных фракций из каллусной культуры S. vulgaris. В качестве исходного растительного материала использовали каллус-ную культуру S. vulgaris, полученную нами, как описано ранее [8]. Замороженную массу каллусной культуры (2,1 кг) термостатировали на водяной бане при 30°. Выделившийся раствор отделяли фильтрованием. Остаток сырья экстрагировали два раза дистиллированной водой при 70° в течение 3 ч. Полученные растворы объединяли, концентрировали, остатки сырья отделяли центрифугированием, полисахарид осаждали из супернатанта четырехкратным объемом 96%-ного этанола. Осадок растворяли в воде, диализовали против дистиллированной воды и лиофилизова-ли, получили исходный, сырой арабиногалактан AG-С, выход 6,4% от веса воздушно-сухого сырья.
Пектин (силенан) экстрагировали из каллусной культуры S. vulgaris водным раствором окса-
лата аммония, как описано ранее [20]. Предварительно остаток сырья последовательно обрабатывали 0,5%-ным раствором формалина и водным раствором соляной кислоты при pH 4,0, при 50° в течение 3 ч. Остаток сырья обрабатывали 0,5%-ным водным раствором оксалата аммония. Объединенный экстракт концентрировали, центрифугировали и осаждали четырехкратным объемом 96%-ного этанола. Полученный осадок растворяли в дистиллированной воде, диализовали и лиофилизовали. В результате получили силенан SVC, выход 11,9% от веса воздушно-сухого сырья.
Фракционирование исходного арабиногалак-тана AG-С. Сырой арабиногалактан AG-С (60 мг) растворяли в 0,01 М NaCl (2 мл) и разделяли с помощью хроматографии на колонке с сефакрилом S-500 (2 см х 85 см, свободный объем V0—75 мл; элюент — 0,01 М NaCl, скорость элюции 0,4 мл/мин). Фракции, соответствующие отдельным пикам на выходной кривой, объединяли, концентрировали, диализовали и лиофилизовали. Получили две полисахаридные фракции: главную AG-C-2, выход 37 мг, Kav 0,5, и минорную AG-C-1, выход 5,2 мг, Kav 0. Процедуру повторяли несколько раз, в результате фракцию AG-C-2 наработали в количестве, необходимом для проведения дальнейших исследований.
Фракцию AG-C-2 (268 мг) растворяли в дистиллированной воде (50 мл) и последовательно разделяли на ультрафильтрационных мембранах (полисульфон, 100 и 50 кДа; «Millipore», США). Фракции концентрировали и лиофилизовали. Получили очищенный арабиногалактан AG-C-2—100, выход 184 мг, молекулярная масса 100—300 кДа, и сопутствующую ему фракцию AG-C-2—50, выход 15 мг, молекуля
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.