МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 6, с. 777-789
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК57.083.3+579.841.11.083.18:577.114.5
СТРУКТУРНОЕ РАЗНООБРАЗИЕ О-ПОЛИСАХАРИДОВ И СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ КЛАССИФИКАЦИЯ PSEUDOMONAS SYRINGAE PV. GARCAE И ДРУГИХ ШТАММОВ ГЕНОМОТИПА 4
© 2004 г. В. В. Овод*, Э. Л. Здоровенко**'1, А. С. Шашков**, Н. А. Комарова**, Ю. А. Книрель**
*Институт медицинских технологий, Университет Тампере, Тампере, Финляндия **Институт органической химии им. НД. Зелинского РАН, Москва Поступила в редакцию 10.11.03 г.
С помощью набора мышиных моноклональных антител (МАт), специфичных к О-полисахаридной цепи липополисахарида, выявлены новые серотипы штаммов Pseudomonas syringae pv. garcae. Структурные исследования показали, что О-полисахарид P. syringae pv. garcae NCPPB 2708 является неизвестным до сих пор линейным L-рамнаном. Он лишен строгой регулярности и состоит из оли-госахаридных повторяющихся звеньев двух типов I и II, которые отличаются различным положением замещения одного из остатков рамнозы и имеют следующие структуры: I: —» 3)-a-L-Rha-(1 —»- 2)-a-L-Rha-(1 —► 2)-a-L-Rha-(1 —► 3)-a-L-Rha-(1 —► II: —► 3)-a-L-Rha-(1 —► 3)-a-L-Rha-(1 —► 2)-a-L-Rha-(1 —»- 3)-a-L-Rha-(1 —Разветвленные О-полисахариды штаммов P. syringae pv. garcae ICMP 8047 и NCPPB 588T имеют такую же L-рамнановую основную цепь, построенную из повторяющихся звеньев I и II, и боковую цепь из (a1 —► 4)- или (a1 —»- 3)-связанных остатков 3-ацетами-до-3,6-дидезокси-0-галактозы (D-Fuc3NAc) соответственно. Охарактеризован ряд эпитопов МАт, связанных с L-рамнановой основной цепью и с боковыми остатками a-D-Fuc3NAc.
Ключевые слова: липополисахарид, О-полисахарид, структура, серологическая классификация, мо-ноклональные антитела, Pseudomonas syringae.
Фитопатогенные бактерии вида Pseudomonas syringae имеют широкий спектр специфичности к растению-хозяину. По способности вызывать заболевания одного или более растений их подразделяют в более чем 50 патоваров, которые не имеют таксономического значения [1]. На основании данных ДНК-ДНК-гибридизации и риботи-пирования 48 патоваров P. syringae и 8 родственных фитопатогенных видов бактерий разделены на 9 геномотипов [2]. Патогенность и данные генетического анализа показывают, что группа P. syringae развивалась дивергентно в течение длительного периода времени. Однако штаммы, входящие в различные геномотипы и патовары, характеризуются одинаковыми или схожими профилями питания (ферментативной активностью), которые, очевидно, сохранились или конвергентно эволюционировали из-за обитания бактерий в сходной окружающей среде высших растений. В результате этого большинство геномотипов не могут быть дифференцированы фенотипически, и, таким образом, для таксономических целей необходимы новые фенотипические характеристики.
Хемотип липополисахарида (ЛПС) и соответствующий серотип являются консервативными
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: evelina@ioc.ac.ru).
фенотипическими характеристиками Р. syringae, которые могут иметь важное таксономическое значение [3, 4]. О-полисахаридные цепи (ОПС) ЛПС всех изученных к настоящему времени штаммов Р. syringae имеют основную цепь, построенную из остатков рамнозы [3-10]. Их структурные различия связаны с абсолютной конфигурацией рамнозы (Ь-ИЬа, Б-ИМ или оба изомера одновременно), размером повторяющегося звена основной цепи (три- или тетрасахарид) и положением замещения остатков рамнозы. Кроме того, О-полисахариды могут отличаться присутствием различных боковых углеводных заместителей, таких как О-рамноза, О-фукоза, 2-ацетамидо-2-дезокси-О-глюкоза или 3-ацетамидо-3,6-дидезок-си-О-галактоза, которые присоединены в различные положения основной рамнановой цепи [3-9].
Серологические исследования ЛПС Р. syringae показали хорошую корреляцию между структурой ОПС (хемотипом) и иммуноспецифичностью (серотипом). Для создания новой серологической классификационной схемы с помощью ЛПС-специфичных МАт было протестировано около 1000 штаммов, представляющих все известные патовары Р. syringae и родственных фитопатогенных бактерий [1, 3-7, 9, 11]. В то же время корреляция между хемотипом и серотипом с одной сто-
Таблица 1. Изученные штаммы различных патоваров Pseudomonas syringae и Pseudomonas coronafaciens, относящиеся к геномотипу 4 [2]
Микроорганизм Штамм Растение-хозяин Страна и год выделения Cepoтип
P. syringae NCPPB 2397T Lolium multiflorum Япония, 1967 O3(3c, 3c1)
pv. atropurpurea NCPPB 239б Lotium sp. Япония, 1967 O3(3c, 3c1)
NCPPB 17б8 Agrostis sp. Великобритания, 1965 O4(4a, 4e)
P. coronafaciens NCPPB 600t Avena sativa Великобритания, 1958 O3(3c)
NCPPB 1253 Avena sativa Великобритания, 1962 O3(3c)
NCPPB 1356 Avena sativa Канада, 1954 rough
NCPPB 1357 Avena sativa Канада, 1962 O4(4a1, 4e)
NCPPB 1327 Avena sativa Канада, 1962 O4(4a1, 4e)
NCPPB S74 Avena sativa Германия, 1959 O4(4a1, 4e)
NCPPB 24S1 Avena sativa Кения, 1970 O4(4a1, 4e)
NCPPB 2680 Avena sativa Новая Зеландия, 1969 O4(4a1, 4e)
NCPPB 2816 Avena sativa Канада, 1933 O4(4a1, 4e)
P. syringae NCPPB 5SST Coffea arabica Бразилия, 1956 O4(4a1, 4e)
pv. garcae NCPPB 512 Coffea arabica Бразилия, 1956 O4(4a1, 4e)
ICMP 5802 Coffea arabica Бразилия, 1976 O4(4a1, 4e)
NCPPB 2708 Coffea arabica Кения, 1972 O4(4a, 4a1, 4a2)
NCPPB 2710 Coffea arabica Кения, 1973 O4(4a, 4a1, 4a2)
ICMP 8047 Coffea arabica Кения, 1974 O4(4a1, 4e2)
P. syringae NCPPB 3683T Oryza sativa Япония,19830 8(8c)
pv. oryzae CFBP 4363 Oryza sativa Япония, 1983 O4(4a1, 4e)
P. syringae NCPPB 3364T Allium porrum Франция, 1978 O9(9c, 9c1)
pv. porri NCPPB 33б5 Allium porrum Франция, 1964 O9(9c)
NCPPB 33бб Allium porrum Франция, 1975 O9(9c)
NCPPB 33б7 Allium porrum Франция, 1979 rough
NCPPB 3545 Allium porrum Нидерланды, 1984 O9(9c, 9c1)
P. syringae NCPPB 1898T Avena sativa неизвестно, 1966 rough
pv. striafaciens NCPPB 2480 Avena sativa Зимбабве, 1971 O3(3c)
NCPPB 2713 Secale&Triticum sp. Мексика, 1973 O1[(1-2)a, (1-2)a1, 1a, 1b]
ICMP 4483 Avena sativa Новая Зеландия O4(4a, 4e)
P. syringae ICMP 8815 Avena sativa Мексика, 1973 O1[(1-2)a, (1-2)a1, 1a, 1b]
pv. zizaniae NCPPB 3690T Zizania aquatica США, 1983 O4(4a1, 4e)
Примечание. CFBP - French Collection of Phytopathogenic Bacteria (INRA, Анжер, Франция); ICMP - International Collection of Microorganisms from Plants (Окленд, Новая Зеландия); NCPPB - National Collection of Plant Pathogenic Bacteria (Харпенден, Великобритания).
роны и генетическими характеристиками с другой стороны остается невыявленной.
С помощью ЛПС-специфичных мышиных по-ликлональных антисывороток и МАт ([11] и неопубликованные данные авторов) были исследованы типовые штаммы всех патоваров Pseudomonas syringae, отнесенных к геномотипу 4 (P. syringae pvs. atropurpúrea, garcae, oryzae, porri, striafaciens, zizaniae и P. coronafaciens). У большинства штаммов ЛПС оказались серологически схожими с ЛПС других патоваров P. syringae, структуры
ОПС которых были установлены ранее [7, 8, 12], тогда как все штаммы Р. syringae ру. рот с 8-ти-пом ЛПС были серологически уникальными. Структуры их ОПС были установлены, и было предложено классифицировать эти штаммы в новую серогруппу 09 [4]. Большинство штаммов Р. syringae ру. garcae, вызывающего пятна на кофе [1, 13, 14], включая типовой штамм патовара КСРРБ 588т, схожи с типовым штаммом вида Р. syringae ру. syringae КСРРБ 281т [8, 15], в то время как некоторые другие штаммы этого пато-
вара были отнесены к двум новым серотипам. В настоящей работе мы описываем строение ОПС и сероспецифичность ЛПС в каждой из трех групп штаммов Р. syringae pv. garcae. Данные по структуре ОПС Р. syringae pv. garcae ICMP 8047 были опубликованы ранее [16].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Бактериальные штаммы, выращивание, получение ЛПС и ОПС. Изученные штаммы представляют все патовары, которые относятся к ге-номотипу 4 (табл. 1). Штаммы Pseudomonas syrin-gae pv. garcae NCPPB 2708 (GSPB 2678, ICMP 5019), NCPPB 588T (ATCC 19864, ICMP 4323, CFBP 1634, GSPB 2676) и ICMP 8047 (NCPPB 1399, GSPB 2680) использовались для определения структуры ОПС.
Бактерии культивировали на плотной среде, содержащей глюкозу и дрожжевой гидролизат (Medium 5, DSMZ GmbH, Германия) при 20-22°C в течение 24 ч. ЛПС выделяли экстракцией трис/ЭДТА-буфером, как описано [3], и деградировали 2% HOAc (1.5 ч, 100°C). ОПС выделяли гель-фильтрацией на колонке (56 х 2.6 cм) с гелем Sephadex G-50 (S) в 0.05 M пиридин-ацетатном буфере (4 мл пиридина и 10 мл HOAc в 1 л воды) при детектировании с помощью дифференциального рефрактометра ("Knauer", Германия).
Химические методы. Анализ моносахаридов и связей проводили, как описано ранее [4]. После гидролиза ОПС 2 M CF3CO2H (120°C, 2 ч) моносахариды идентифицировали методом ГЖХ в виде ацетатов полиолов. Абсолютные конфигурации определяли методом ГЖХ ацетилированных (+)-2-октилгликозидов. Метилирование проводил MeI в диметилсульфоксиде в присутствии NaOH, гидролиз проводили, как описано выше, частично метилированные сахара ацетилировали и анализировали с помощью ГЖХ-МС.
Для распада по Смиту, О-полисахариды (1220 мг) окисляли 0.1 M NaIO4 в темноте (48 ч, 20°C), восстанавливали NaBH4 и обессоливали на колонке (80 х 1.6 см) с гелем TSK HW-40 (S) в 1% HOAc. Продукты гидролизовали 2% HOAc (2 ч, 100°C), восстанавливали NaBH4 и фракционировали на геле TSK HW-40 (S) в воде. При необходимости продукты дополнительно очищали повторной хроматографией на той же колонке.
Инструментальные методы. ГЖХ проводили на капиллярной колонке Ultra 2 на приборе Hewlett-Packard 5880 (Paolo Alto, США) и ГЖХ-МС на хроматографе Hewlett Packard 5890, оборудованном масс-спектрометром NERMAG R10-10L (Франция); использовали градиент температур от 160°C (1 мин) до 290°C (Ю^/мин) или от 160°C (3 мин) до 250°C О^/мин) соответственно. Относительное содержа-
Таблица 2. Мышиные МАт, специфичные к P. syringae ЛПС с L-рамнановой основной цепью ОПС
МАт Изотип Получено против штамма
Ps3c IgG2a P. syringae pv. atrofaciens IMV 948
Ps4a IgM P. syringae pv. syringae NCPPB 281T
Ps4ax IgM P. syringae pv. garcae ICMP 8047
Ps4a2 IgM P
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.