БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2014, том 31, № 6, с. 401-409
УДК 577.352.26
СТРУКТУРНЫЕ ФАКТОРЫ ВО ВЗАИМОДЕЙСТВИИ ЛИЗИНА И ПОЛИЛИЗИНОВ С ЛИПИДНЫМИ МЕМБРАНАМИ
© 2014 г. Н. И. Марукович1, А. М. Нестеренко2, Ю. А. Ермаков1*
Институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН, 119071, Москва, Ленинский просп., 31, стр. 4 *электронная почта: yury.a.ermakov@gmail.com 2Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр. 40
Поступила в редакцию 14.07.2014 г.
Исследовано влияние адсорбции лизина и полилизина на распределение электрического поля вблизи границы липидных мембран, сформированных из кардиолипина (СЬ) и фосфатидилсерина (Р$). Как показали электрокинетические измерения в суспензии липосом из этих липидов, зависимость дзета-потенциала липосом от концентрации лизина у обоих липидов примерно одинаковая. Эта зависимость хорошо описывается моделью Гуи—Чепмена и изотермой адсорбции, которая учитывает распределение молекул лизина между бислоем и водой с константой К = 1.2 х 10-3 М-1 и независимое связывание катионов калия с молекулами липида с константой К = 1 М-1. Изменение суммарного граничного потенциала в присутствии лизина регистрируется и на плоских бислойных липид-ных мембранах (БЛМ) из тех же липидов методом компенсации внутримембранного поля. Однако влияние лизина на граничный потенциал БЛМ оказывается слабее: заметные изменения потенциала наблюдаются при концентрациях, примерно на 1.5 порядка больших, чем в случае концентраций, при которых проявляются изменения поверхностного потенциала в электрокинетических измерениях. Этот факт указывает на изменение в противоположных направлениях поверхностной и дипольной компонент граничного потенциала, которые компенсируют друг друга при адсорбции лизина на поверхности бислоя. Такое объяснение подтверждается результатами анализа молекулярно-динамических симуляций бислоев из диолеилфосфатидилсерина фОР8) в присутствии лизина, согласно которому адсорбция лизина приводит к изменению дипольного потенциала при нарушении водородных связей вблизи фосфатных групп липида, но не карбоксильных групп. В этом случае одинаковый компенсационный эффект прогнозируется и наблюдается в опытах с мембранами из СЬ и Р$. Изменение дипольного потенциала до 40 мВ в присутствии лизина согласуется с амплитудой медленной фазы в кинетике изменений граничного потенциала при адсорбции полилизинов. Эта фаза может быть отнесена к изменению конформации полипептида и/или к структурным изменениям в липидном бислое.
Ключевые слова: липидные мембраны, адсорбция лизина, полилизины, поверхностный и диполь-ный потенциалы, электрокинетические измерения, компенсация внутримембранного поля, молекулярная динамика.
Б01: 10.7868/80233475514060036
ВВЕДЕНИЕ
Известно, что поликатионы разной структуры адсорбируются на отрицательно заряженных поверхностях клеточных и модельных липидных мембран и существенным образом меняют распределение электрического поля на их границах [1-3]. Наиболее подробно такие эффекты исследованы для полипептидов на основе лизина, которые широко используются для разработки лекарственных препаратов и решения многих биотехнологических задач [4-7]. Тем не менее практически отсутствуют сведения о влиянии полипептидов на электрическое поле в полярной области мембран, которое определяет дипольную
компоненту граничного потенциала. Согласно нашим исследованиям, эта компонента может служить индикатором структурных изменений в полярной области мембран, которые определяются конкретным липидным составом мембран и отражают состояние гидратации полярных групп фосфолипидов [8]. Ранее [9] мы показали, что кинетика адсорбции полилизинов разной молекулярной массы на липидных мембранах состоит из двух фаз изменения граничного потенциала противоположного знака. Для интерпретации этого факта нами была сформулирована гипотеза, согласно которой эти фазы могут быть отнесены к изменению поверхностного и дипольного потен-
циалов. Основная роль в последнем случае была отнесена к взаимодействию лизиновых оснований с полярными группами фосфолипида и, как следствие, к изменению состояния гидратации таких групп. Эта гипотеза качественно согласуется с результатами анализа молекулярной структуры, полученной при симуляции системы липид-лизин методами молекулярной динамики (МД). В данной работе мы продолжаем исследование этой системы и приводим дополнительные экспериментальные факты и теоретические аргументы в пользу этой гипотезы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе исследованы препараты лизина (L(D)-lysine, hydrochloride, Lys) и олиголизина, содержащего примерно 12 оснований (poly-D-lysine hydrobromide, мол. вес 2500, Lys-12, Sigma, США). Из-за наличия двух аминогрупп (рК = = 8.95 и 10.5) и одной карбоксильной (рК = 2.18) молекулы лизина в широком диапазоне рН (5.0— 9.0) несут единичный положительный заряд. Контрольное измерение рН при добавлении раствора лизина до концентрации 1 М в безбуферный раствор KCl не обнаруживает существенного изменения рН.
Для приготовления липосом и формирования БЛМ в работе использовали растворы фосфоли-пидов в хлороформе (Avanti Polar lipids, США): кардиолипин (CL) сердца быка, фосфатидилсе-рин (PS) из мозга свиньи. Растворы высушивали в круглодонной стеклянной колбе под вакуумом в роторном испарителе около 50 мин. Для равно -мерного распределения липида по стенкам колбу вращали около 10 мин. После высушивания добавляли фоновый электролит и интенсивно встряхивали на приборе Bio Vbrtex V1 до образования суспензии липосом с конечной концентрацией липи-да 1 мг/мл. Все измерения с липосомами и плоскими БЛМ проведены в фоновом электролите 10 мМ KCl, pH около 6.5 при температуре 22°C.
Исходный заряд мембран, а также его изменение при адсорбции лизина определяли с помощью электрокинетических измерений в суспензии липосом. Электрофоретическую подвижность липосом измеряли методом динамического светорассеяния на оборудовании Zetasizer II (Malvern Inst., Великобритания) с применением коррелятора PhotoCor-SP (США). Расчет спектра электрофоретической подвижности производился программой, разработанной авторами на основе алгоритма компании Malvern. Спектр подвижности липосом обычно имел сложную форму, для дальнейшего анализа были использованы пики с максимальной амплитудой.
Плоские БЛМ формировали по методу Мюллера—Рудина [10] из раствора липидов в декане (15 мг/мл) на отверстии диаметром около 1 мм в
перегородке тефлоновой ячейки. Края отверстия предварительно обрабатывали раствором липида, ячейку высушивали, заполняли ее фоновым электролитом (по 2 мл в каждом отсеке) и наносили на отверстие липид. Измерения проводили с помощью хлорсеребряных электродов после образования бислойной черной пленки, что контролировали по изменению электрической емкости при наложении на мембрану переменного напряжения (50 мВ, 274.5 Гц). Для регистрации изменений граничного потенциала применяли метод компенсации внутримембранного поля (КВП) и установку, описанную ранее [11]. Для изоляции хлорсеребряных электродов от растворов лизина и полилизинов применяли агаровые мостики, приготовленные с раствором фонового электролита.
Молекулярно-динамические симуляции выполнены с использованием полноатомного силового поля OPLS-AA, разработанного в [12], с явной водой TIP3P при помощи программы GROMACS [13] с периодическими граничными условиями, шагом интегрирования 0.5 фс и средним временем финального расчета 100 нс. Бислои из дио-леоилфосфатидилсерина (DOPS) уравновешивались в NpT-ансамбле при температуре 300 K. Мембраны были сформированы из гексагонально упакованных липидов и уравновешены в растворе KCl, затем меняли соотношение калий/лизин и уравновешивали систему снова в течение 40 нс. Следующие 60 нс были использованы для финальных вычислений. Топология липидов, протокол МД и обработка данных подробно описаны нами ранее [14, 15]. При обработке траекторий использовали геометрический критерий образования водородных связей: расстояние между тяжелыми атомами донора и акцептора меньше 0.35 нм, а угол донор — водород — акцептор больше 145°.
Количественный анализ экспериментальных данных проведен в рамках модели Гуи-Чепмена-Штерна [16]. Теоретические кривые построены в рамках этой модели при условии, что катионы калия связываются с отрицательно заряженными фосфолипидами с константой К = 1 М-1, а молекулы лизина распределены между поверхностью бислоя и водным раствором с константой Kd = = 1.2 х10-3 М-1. Соответствующая изотерма в этом случае принимает вид:
1
1 + Kic2 ( 0)
+ Kdc2( 0).
(1)
Здесь с(0) — концентрация катионов (лизина или калия) в диффузном слое вблизи поверхности мембраны, связанная с концентрацией этих катионов в объеме с ЪиШ распределением Больцмана.
С(0) = С, bulkexP I -
ezMpc)^ k T J.
max
Поверхностный потенциал, ф(0), и поверхностный заряд, а, связаны формулой Грэма [17], которая учитывает все катионы и анионы для электролита произвольного состава:
ст0 = 2kT
Т c
bulk
exp
(0 )Л - 1
k T J .
(3)
В рамках этой модели размеры молекул лизина, так же как и неорганических ионов, не учитываются, а их вклад в ионную силу раствора I и деба-евскую длину экранирования, х-1, рассчитываются по формулам:
I = 0.5ТCi,buikZi,
1 _ (ie_ci1buik\
-1/2
X
V 660kT J
(4)
(5)
Для расчета поверхностного потенциала по результатам электрокинетических измерений используется известное соотношение между потенциалом на поверхности, ф(0), и измеренным в опыте значением дзета-потенциала в плоскости скольжения, ф(8), которая предполагается удаленной от поверхности на расстояние 8 = 0.2 нм [18, 19]. Различие поверхностного и дзета-потенциалов описывается формулой (6) с учетом изменения ионной силы раствора (4) с ростом концентрации лизина в растворе:
th
ej№) = thfeÄ) exp(-xx).
4 kT J
4 kT
(6)
«
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты электрокинетических измерений в суспензии липосом из двух анионных фосфоли-пидов при изменении концентрации лизина представлены на рис. 1а, а их сравнение с изме
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.