научная статья по теме Структурные особенности изоферментов Na+,k+-ATP-азы мозга теленка Химия

Текст научной статьи на тему «Структурные особенности изоферментов Na+,k+-ATP-азы мозга теленка»

УДК 577.152.361*3713

СТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ИЗОФЕРМЕНТОВ ^+,К+-АТР-АЗЫ МОЗГА ТЕЛЕНКА

© 2003 г. Н. М. Владимирова#, Е. Н. Сауткина, Т. И. Муравьева, Т. В. Овчинникова, Н. А. Потапенко

Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 ГСП, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Поступила в редакцию 21.12.2001 г. Принята к печати 04.02.2002 г.

Получены функционально активные препараты изоферментов Ыа+,К+-АТР-азы из мозга теленка, содержащие каталитические субъединицы трех типов (а1, а2, аЗ), с использованием двух методов: селективного удаления примесных белков по методу Иоргенсена (.Го^епзеп, 1974) и селективной со-любилизации фермента с последующей реконструкцией мембранной структуры по методу Эсмана (Евтапп, 1988). Определены константы ингибирования полученных изоферментов оуабаином. Оценен реальный изоферментный состав Ыа+-насоса для серого вещества, содержащего клетки глии. и ствола мозга, содержащего нейроны. Показано, что плазматические мембраны клеток глии содержат в основном Ма+,К+-АТР-азу а1 (31-типа и минорное количество изоферментов а2(32 ((31)- и а3(31 ((32)-типа, а аксолемма - изоферменты а2(31- и аЗ(31-типа. На основании результатов углеводного анализа обнаружено, что препараты ферментов а1|31-типа, выделенные из серого вещества мозга, имеют существенные различия по сравнению с ферментом такого же состава из почек в характере гликозилирования (31-изоформы. Выявлена повышенная чувствительность к эндогенному протео-лизу каталитической субъединицы аЗ На+,К+-АТР-азы нейронов. Локализована точка специфического протеолиза в аминокислотной последовательности, соответствующей одной из зон наибольшей вариабельности для субъединиц а1, а2, аЗ, а4, но характерной для аЗ-изоформ различных видов: РЫБЫК492 -I У493 (по нумерации аЗ-субъединицы человека). Впервые показано присутствие (33-изоформы тубулина (белка цитоскелета) в высокомолекулярном комплексе аЗ(31-изофермента Ма+,К+-АТР-азы, выделенном из аксолеммы нейронов ствола мозга, и его связь с каталитической субъединицей аЗ.

Ключевые слова: Ыа+,К+-АТР-аза; изоформы; изоферменты; аксолемма; тубулин; глико-зилирование; протеолиз.

ВВЕДЕНИЕ

№+-насос - транспортная №+К+-АТР-аза плазматической мембраны (КФ 3.6.1.37) поддерживает низкие концентрации ионов и высокие - К+ в цитоплазме практически всех животных клеток. Она представляет собой гетеродимер субъединиц двух типов: а и (3. а-Субъединица - каталитическая, содержит участки связывания катионов и специфического ингибитора - оуабаина. Глико-зилированная (3-субъединица важна для внутриклеточного транспорта а-субъединицы к плазматической мембране, защиты а-субъединицы от эндогенного протеолиза и правильного встраивания фермента в плазматическую мембрану [1,2].

В настоящее время для а-субъединицы показано существование четырех изоформ (а1, а2, аЗ

Сокращения: ОЕР- диизопропилфторфосфат; С12Е8-доде-циловый эфир октаэтиленгликоля; срА, срВ, срУ - карбок-сипептидазы А, В, У; РУР-40 - поливннилпирролидон-40. # Автор для переписки (эл. почта: vla@mail.ibch.ru; тел.: (095) 330-66-47).

и а4) и для (3-субъединицы трех изоформ ((31, (32, (33), являющихся продуктами разных генов [2-4]. Возникло новое представление о строении Na+-насоса, согласно которому он включает в себя не только хорошо описанный гетеродимер а 1(31 ("почечный тип"), но и представляет собой семейство двенадцати потенциально возможных типов изоферментов различного ал(3»7-гетеродимерно-го состава. Ситуация с количеством изоферментов может быть значительно усложнена рядом факторов. Во-первых, молекулярная гетерогенность (3-субъединицы может быть обусловлена не только экспрессией структурных изоформ (¡31, [32, (33), но также различием в характере их гликозилирования [5,6]. Во-вторых, показано, что в ряде тканей с Ыа+,К+-АТР-азным комплексом ассоциирует третья субъединица (у), структура которой родственна трансмембранным белкам 1-типа, осуществляющим ионный транспорт, таким, как фосфолемман, каналиндуцирующий фактор (CHIF) и Mat-8 (Mammary tumor associated protein) [2, 4]. Для у-субъединицы также показано существова-

ние нескольких изоформ [2]. Однако принадлежность этой субъединицы к Na+-Hacocy и ее роль для функционирования насоса точно не доказана и широко дискутируется сейчас в литературе.

al-Изоформа каталитической субъединицы наиболее изучена, определена ее структура для большого числа видов животных. Она экспрессирует-ся практически во всех тканях, ей приписывают функцию регуляции содержания цитозольного Na+ и называют изоформой - "домоправительницей". "Именно на ферменте а 1(31 -типа получен практически весь объем данных о топографии и функциональных доменах фермента. Строение изоформ а2 и аЗ известно для небольшого числа объектов, распределение этих изоформ более тканеспеци-фично. а4-Изоформа выделена пока из единственного источника (семенников крысы), хотя небольшое ее количество детектировано также в мозге [4], данные же о функциональных свойствах этой изоформы практически отсутствуют.

Несмотря на то что три изоформы каталитической субъединицы (al, a2 и аЗ) имеют большую структурную гомологию (>94%), спектр их функциональных различий весьма широк. Так, они по-разному ингибируются кардиотонически-ми стероидами как растительного происхождения (например, оуабаином) [3,7, 8], так и эндогенными дигиталисподобными соединениями [4, 9]; для них характерны существенные различия в антагонизме между К+ и оуабаином при физиологических значениях концентрации К+ [4, 7]. Изоформы различаются сродством к ATP, Na+, чувствительностью к ингибированию ионами Са2+, устойчивостью к действию оксидантов, радикалов, эндогенных протеиназ, а также механизмами регуляции их биосинтеза и клеточной активности [9]. Причина таких глубоких различий неясна, литературные сведения противоречивы, а данные о функциональных свойствах изоформ, как правило, получены не для выделенных изоферментов, а анализом либо микросом, содержащих эти изоформы, либо продуктов экспрессии соответствующих генов субъединиц. Анализ литературных данных показал, что широкий спектр функциональных различий изоформ может быть обусловлен не только тонкими различиями в их первичной структуре; большое влияние может оказывать также липидное окружение [2,4], углеводная компонента |3-субъединицы [6], способность к взаимодействию с мембранными и цитоплазматиче-скими белками [2, 4, 10]. Поэтому система, в которой тестируются свойства изоформ субъединиц и изоферментов, должна быть максимально приближена к существующей in vivo.

В настоящее время стало ясно, что регуляция №+-насоса включает факторы, влияющие как на функционирование самого фермента, так и на его пространственное распределение в клеточной мем-

бране. В поляризованном эпителии Ма+,К+-АТР-аза распределена в основном в базолатеральной мембране [11], и это распределение осуществляется за счет взаимодействия с белками цитоскеле-та (актином, фодрином и анкирином) [12-14]. Существование нескольких изоформ для каждой субъединицы Ыа+-насоса значительно усложняет анализ его пространственного распределения в мембране. На повестку дня встает новый вопрос: изучение механизма распределения изоформ.

Наименее понятно функционирование Ыа+,К+-АТР-азы в клетках мозга, где Ка+-насос наряду с традиционными функциями участвует в межклеточном взаимодействии нейрональных и глиаль-ных клеток [15], в связывании с белками цитоске-лета [6, 16], где экспрессируются все известные сегодня изоформы обеих субъединиц Ка+,К+-АТР-азы и где клеточная геометрия имеет фундаментальное значение для функционирования многих белков.

Цель данной работы - выделение и характеристика изоферментов №+,К+-АТР-азы, реально функционирующих в различных клетках мозга, выяснение их структурных особенностей.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Обнаружение в мозге всех известных изоформ вызвало ряд важных вопросов: какие типы изоферментов Ка+-насоса действительно функционируют в клетках мозга, каковы их свойства, продуцируются ли различные гетеродимеры в клетках одного вида, какой тип гетеродимера выполняет адгезионную функцию в нервной системе, существуют ли специфические особенности, характерные для изоферментов мозга, отличающие их от изоферментов такого же гетеродимерного типа из других тканей.

Сложность ответа на эти вопросы обусловлена прежде всего тем, что выделены и хорошо охарактеризованы только ферменты а 1|31 -"почечного" типа [1,2]. Изоферменты из мозга выделены не были, а данные о свойствах изоформ получены не путем исследования выделенных изоферментов, а анализом либо микросом, содержащих эти изоформы, либо продуктов экспрессии соответствующих генов, где, как правило, отсутствует нативное липидное и белковое окружение, а также углеводная компонента |3-субъединицы. Поэтому первый этап исследования состоял в разработке методов для выделения функционально активных изоферментов.

В качестве объектов нами были выбраны серое вещество коры мозга теленка, содержащее клетки глии, и ствол, богатый миелинизирован-ными аксонами. Ствол также служил исходным материалом для получения аксолеммы - плазматической мембраны миелинизированных аксо-

нов. Получение и характеристика микросомного материала подробно описаны в нашей работе [17].

Для выделения Ма+,К+-АТР-азы используют в основном два разных методических подхода: а) селективное удаление примесных белков с помощью ионного детергента додецилсульфата натрия (в присутствии АТР) по методу Йоргенсена [18], при котором №+,К+-АТР-аза остается мемб-раносвязанной, в нативном липидном окружении и функционально активной; б) селективную со-лю^илизацию №+,К+-АТР-азы с помощью неионного детергента С12Е8 (додецилового эфира окта-этиленгликоля) с последующей реконструкцией мембранной структуры в присутствии ионов Са2+ или Мп2+ [19]. Этот детергент позволяет сохранять в значительной степени межбелковые контакты и поэтому ранее часто использовался для изучения субъединичной структуры многих мембранных белков и их взаимодействия с внешними белковыми структурами.

Метод Иоргенсена был основным при выделении Ма+,К+~А'ГР-азы из почек различных видов животн

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком