w
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1995, том 21, M 7, с. 492 - 497
УДК 577.113.5
СТРУКТУРНЫЕ СВОЙСТВА РИБОСОМНОГО БЕЛКА S8 ИЗ ЭКСТРЕМАЛЬНОГО ТЕРМОФИЛА Thermus (hemophilus
© 1995 г. В. С. Высоцкая*, У. Ф. Насибуллин, В. Н. Уверский, К. С. Василенко, Н. В. Нарижнева, М. Б. Гарбер
Институт белка РАН, 142292, Пущине Московской обл. Поступила в редакцию 03.08.94 г.
Ген рибосомного белка S8 из экстремального термофила Thermus thermophilus экспрессирован в Escherichia coli с использованием штамма BL21(DE3) и вектора рЕТЗ-1. Разработана методика выделения этого белка из штамма-суперпродуцента, позволяющая получать 8 - 12 мг продукта из 1 л культуры. С помощью спектроскопии КД определена вторичная структура белка S8. Показано, что он обладает высокой устойчивостью к денатурирующим агентам.
Ключевые слова: Thermus thermophilus; рибосомный белок, вторичная структура.
Известно, что рибосомный белок S8 в Е. coli играет существенную роль как в сборке 308-суб-частицы [1], так и в регуляции экспрессии генов рибосомных белков 5/?с-оперона [2, 3]. Во время сборки малой субчастицы белок S8 независимо от других белков связывается с центральным доменом 16S РНК и вместе с белками S15, S6, S18 формирует боковой выступ ("платформу") 30S-cy6-частицы [4]. 88-Связывающий участок 16S РНК представляет собой несовершенную шпильку, образованную нуклеотидной последовательностью 583 - 653 [5 - 7]. Использование различных химических и генно-инженерных методов (химические модификации [8], УФ-индуцируемое сшивание [9], ферментативный гидролиз [10], сайт-направлен-ный мутагенез [11]) позволило локализовать структурные детерминанты рРНК Е. coli, необходимые для взаимодействия с белком S8. Было обнаружено, что 3 неспаренных аденина (А595, А640, А642), а также неканоническая пара U598 • U641, окруженная двумя G • С-парами, находятся в прямом контакте с белком S8 [7].
Белок S8 известен также как репрессор трансляции буУс-мРНК, кодирующей 11 рибосомных белков (L14, L24, L5, S14, S8, L6, L18, S5, L30, L18, L36), а также секреторный белок SecY [2, 3]. При избыточном синтезе (по отношению к 16S РНК) белок S8 связывается с spc-мРНК в начале ее третьего цистрона, кодирующего рибосомный белок L5. В результате репрессируется трансляция цистрона ф/5 и всех следующих цистронов за счет "последовательной трансляции" полицистронной мРНК |12]. Экспрессия двух предыдущих генов (rpl 14 и гр124) "ретрорегулируется" в результате деградации s/jc-mPHK [13]. Фрагмент мРНК,
* Автор для переписки.
который узнается и защищается белком 88 при обработке нуклеазами, был выделен и охарактеризован [14]. Было обнаружено, что структуры участков этой мРНК и рРНК, связывающих рибосомный белок 88, очень схожи.
Участки мРНК и 168 РНК, узнаваемые белком 88, изучены достаточно основательно, но данные о структуре самого белка 88 и его РНК-связывающем центре немногочисленны и отрывочны. В ряде работ были получены результаты, указывающие на то, что за узнавание и специфическое связывание рРНК и мРНК отвечает С-ко-нец белка 88 [15 - 17]. Все эти данные были получены для белка 88 из Е. сой, но для структурных исследований рибосомные белки из Е. сой являются плохими объектами вследствие их низкой стабильности. В связи с этим в группе структурных исследований аппарата трансляции Института белка была начата работа по выделению белка 88 из экстремального термофила ТИеппш (Иеппо-рЫ1ш. Выбор Т. ШегторкИш в качестве источника для выделения рибосомных белков объясняется тем, что, с одной стороны, по организации аппарата трансляции эта грамотрицательная бактерия похожа на хорошо изученную Е. соН, а с другой -ее белки термостабильны, обладают повышенной устойчивостью к протеолитическим ферментам и денатурирующим веществам и поэтому более перспективны для структурных исследований.
В 1993 г. в нашей группе совместно с лабораторией проф. Эресманна (Страсбург, Франция) была определена первичная структура белка 88 из Т. гкегторкИия [18]. Позднее ген белка 88 был клонирован, секвенирован и экспрессирован в штамме Е. соН ВЬ21(ОЕЗ) [19]. Получение штам-ма-суперпродуцента для белка Б8 из Т. ^егторШиз
позволило выделить этот белок в препаративных количествах, необходимых для изучения его структурных особенностей физическими методами.
Суперэкспрессия гена рибосомного белка 55 из Т. МегторИИш в Е, соИ
Для экспрессии гена рибосомного белка Б8 из Т. ИгегторШш был выбран штамм Е. соИ ВЬ21(1)ЕЗ), несущий на хромосомной ДНК ген Т7-РНК-поли-меразы под контролем ]ас1)У5-промотора, и вектор рЕТЗ-1, содержащий промотор, сайт связывания и терминирующий сигнал фага Т7 [20]. Использование штамма ВЬ21(ВЕЗ) и плазмиды рЕТЗ-1, сконструированных Штудиером для экспрессии генов токсичных белков, позволяет вначале наработать биомассу клеток, а затем добавлением индуктора изопропилтиогалактозида (1РТС0 запустить синтез Т7-РНК-полимеразы и тем самым включить экспрессию встроенного под контроль Т7-промотора гена. Ген рибосомного белка Б8 был амплифицирован с использованием полиме-разной цепной реакции (ПЦР) и затем клонирован в плазмиду рЕТЗ-1 по сайтам ШеI и ХИо\. Секвени-рование амплифицированного гена не выявило каких-либо ошибок 7йг/-полимеразы. Рекомбинант-ные клоны ВЬ21(ОЕЗ)/рЕТ-иЬ88 растили так, как описано в "Экспериментальной части". Белок 88 составил приблизительно 10% общего продуцируемого клеткой белка. В основном белок накапливался в клетке в растворимой форме.
Выделение гомогенного препарата рибосомного белка 58 из суперпродуцентного штамма ВЬ21(ОЕЗ )1рЕТ-иН38
Предложенная нами методика выделения белка 58 из суперпродуцентного штамма включает две основные стадии: 20 мин прогревания пострибо-сомного лизата при 70°С и ионообменную хроматографию на колонке СМ-Тоуореаг1. В результате прогревания клеточные белки Е. соИ денатурируются, образуя нерастворимый осадок, тогда как основная часть термостабильного белка Б8 остается в растворе. На этом этапе необходимо присутствие №С1 в высокой концентрации, чтобы избежать со-осаждения белка с белками Е. соИ. Прогревание позволяет в 3 - 4 раза очистить белок 88. После этого было достаточно одной хроматографии на колонке СМ-Тоуореаг1, чтобы получить препарат белка 88 с чистотой 95 - 98% по данным электрофоре-тического анализа (рис. 1, 4). Предложенная схема выделения белка 88 позволяет из 4 - 5 г клеток (1 л клеточной культуры) выделить 8 - 12 мг белка.
Сравнение физико-хи^иических свойств белков 55 из Т. ЖегторкИия и Е. соИ
Вопрос о сравнительном исследовании свойств гомологичных белков из термофильных и мезо-фильных источников не нов и неоднократно под-
Рис. 1. Электрофорез в 15% ПААГ в присутствии грубого клеточного лизата после осаждения де-бриса (/); безрибосомного экстракта до (2) и после 20 мин прогревания при 70°С (3); препарата белка 88 после СМ-Тоуореаг1 (4); белка 58, выделенного из рибосом Т. ШегторИНш (5).
нимался в литературе (см., например, [21 - 23]). Такие исследования позволяют получить более глубокое представление об основах структурной стабильности белковой молекулы. Они также дают возможность понять, как природа приспосабливает структуру белков к экстремальным условиям среды, и, наконец, открывают перспективы к искусственной стабилизации белков посредством химических модификаций или специфического направленного мутагенеза.
Спектры КД белка 88 из Т. МегторкИш были исследованы в РМЕ-буфере. Выбор этого буфера вызван тем, что КЕ и фосфат калия меньше поглощают в дальней области УФ по сравнению с трис-ацетатом и КС1 [15]. Из анализа полученного спектра КД в дальней УФ-области (рис. 2) можно сделать вывод, что белок 88 из Т. Жегто-рЫШ, как и аналог из Е. соИ, имеет выраженную вторичную структуру. Расчеты, произведенные
Таблица 1, Вторичная структура белка S8 из T. thermo-philus (Tth) в сравнении сданными работы [15] по белку S8 из Е. coli (Eco)
Белок
Содержание элементов вторичной структуры, %
а-спирали
ß-структуры
неупорядоченный клубок
S 8 Tth
S8 Eco
15 11
Из КД-снектров
60 25
58 31
По аминокислотной последовательности
S8 Tth 29 20 51
S8 Eco 27 17 56
[9J х 1 ООО, град х см2 х дмоль"1 lOi
.О.*
2 У
'»«•»«■■••••^ СГ
000Oû0Oci0000 1
jr
о»
р•
200
220
240 нм
Рис. 2. Спектры КД рибосомных белков S8 из T. thermophilus (1) и coli (2).
по методу Провенчер-Г'лукпера ¡24], показали, что содержание а-спиральных участков составляет 12%, а ß-структурированных - 60%.
В белке S8 из Е. coli содержание а-спирали составляет 10 - 13%, ß-структуры-56 -60% и неупорядоченного клубка - 30 - 31% [15]. Таким образом, эти белки имеют примерно одинаковое содержание а- и ß-структурированных участков (табл. 1), несмотря на то что степень их гомологии по первичной структуре лишь 47% [18].
Полученное нами предсказание вторичной структуры для белков S8 из T. thermophilus и Е. coli с использованием алгоритмов, основанных на матричном аппарате Крамерса-Ванье для расче-
Таблнца 2. Термодинамические характеристики* белков S8 из Т. thermophilus (Tth) и Е. coli (Eco) [15J
Белок AGH2o> [Мочевина] l/2, m,
ккал/моль M ккал/(моль M)
S 8 Tth 6.5 3.7 1.8
SSEco 2.3 2.6 0.9
* - изменение свободной энергии стабилизации в отсут-
ствие денатуранта; [ мочевина],/2 - молярная концентрация мочевины в точке перехода; т - мера "кооперативности". Определены из анализа кривых / и 2 рис. 4 согласно методике [15].
та одномерной кооперативной системы [25 - 27], привело к следующему распределению структурированных участков в белках S8 из T. thermophilus и Е. coli: а.- спирали - 29 - 27%, ß-структуры -20 и 17% (рис. 3). Представленные результаты предсказания отличаются от данных, полученных с помощью спектроскопии КД, особенно по оценке содержания ß-структуры. Подобные результаты, когда теоретически предсказанное содержание ß-структуры было значительно ниже значений, определенных из анализа КД-спектров, были получены также и для других рибосомных белков [28].
Особый интерес представляет локализация в белке S8 РНК-связывающего мотива. Для ряда эу-кариотических РНК-связывающих белков, пространственная структура которых была определена на основе рентгеноструктурного анализа, бы
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.