МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2004, том 38, № 3, с. 413-419
== ГЕНОМИКА. ТРАНСКРИПТОМИКА. ПРОТЕОМИКА =
УДК 575.133:576.311.347
СТРУКТУРНЫЕ ВАРИАЦИИ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ГЕНОМА САХАРНОЙ СВЕКЛЫ (Beta vulgaris L.) В ОБЛАСТИ ГЕНА rps3 И orf215, АССОЦИИРОВАННЫЕ С ПРИЗНАКОМ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ
МУЖСКОЙ СТЕРИЛЬНОСТИ
© 2004 г. М. К. Иванов, А. С. Ревенко, Г. М. Дымшиц
Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск, 630090
Поступила в редакцию 01.08.2003 г.
С использованием 5'-вырожденных праймеров, подобранных компьютерным анализом, проведено сравнительное типирование мтДНК сахарной свеклы S- и N-типов из различного линейного материала. мтДНК N-типа типична для нормальных растений, мтДНК S-типа участвует в развитии ци-топлазматической мужской стерильности. Выявлен ряд N- и S-специфичных маркеров, соответствующих транскрибируемым митохондриальным генам. Один из маркеров принадлежит району orf215 в мтДНК N-типа. Построена физическая карта соответствующего района мтДНК S-типа и найдены существенные различия между геномами двух типов. Обнаружен N-специфичный маркер, включающий реорганизованную область гена rps3 и укороченную копию гена atp9. Исходя из нук-леотидной последовательности этого маркера, разработана схема трехпраймерной ПЦР, с помощью которой показано, что в мтДНК сахарной свеклы представлены одновременно оба варианта области гена rps3, причем обнаруженный нами вариант содержится в субстехиометрических количествах.
Ключевые слова: сахарная свекла, мтДНК, цитоплазматическая мужская стерильность, вырожденные праймеры, рестрикционное картирование, молекулярные маркеры, транскрипционный спектр.
Цитоплазматическая мужская стерильность (ЦМС), обусловленная нарушениями микроспо-рогенеза, выражается в формировании пыльников с абортивной пыльцой. ЦМС, характерная для многих видов высших растений, наследуется по материнской линии. Генетическая система ЦМС у сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) впервые описана Оуэном [1]. ЦМС у этого вида проявляется в результате взаимодействия рецессивных аллелей как минимум двух ядерных генов - восстановителей фертильности (Fr-fr), и особого типа цитоплазмы (S-тип) с измененной структурой и экспрессией митохондриального генома. Связь перестроек мтДНК с развитием ЦМС у сахарной свеклы до сих пор не установлена, несмотря на то что известны ассоциированные с ЦМС структурные перестройки и/или изменения спектра транскрипции ряда митохондриальных генов (cob, coxI, coxII, atpA, atp6, atp9, rps3 и orf324). Проведен структурный анализ перестроек в этих районах [24]. Развитие ЦМС как правило сопровождается изменением набора плазмидоподобных мтДНК [5]. Введение в генотип растений с ЦМС доминантных аллелей Fr-генов приводит к частичному восстановлению фертильности. Структура митохондриального генома при этом не изменяется (S-тип), но изменяется профиль его транскрипции [4].
* Эл. почта: imk@ngs.ru
Цель настоящей работы - поиск новых молекулярных маркеров, соответствующих транскрибируемым последовательностям и позволяющих различать цитоплазму К- и Б-типа, с использованием ПЦР с вырожденными праймерами, подобранными компьютерным анализом.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
мтДНК из листьев и корней сахарной свеклы с
цитоплазмой 14-типа (СОАН-31, СОАН-243, СОАН-252, Безотнинская-70) и Б-типа (цмсСОАН-31, цмсСОАН-98, цмсСОАН-252, мс704) выделяли согласно [6] с последующей очисткой на 8ерИаегу1 Б1000. Весь растительный материал любезно предоставлен С.Г. Вепревым, Е.В. Левитесом и С.И. Малецким (лаборатория популяционной генетики растений ИЦиГ, Новосибирск).
Суммарную ДНК из листьев сахарной свеклы
выделяли согласно [7].
мтРНК из листьев и цветоносов выделяли, как описано в [8]. Для исключения гетероплазматич-ных образцов проводили тест на гетероплазмию с использованием трехпраймерной ПЦР, специфичной к гену Мрб [9].
Саузерн- и нозерн-блот-гибридизацию проводили при 42°С в растворе, содержащем 50% фор-мамида [10]. Радиоактивные зонды для гибриди-
Таблица 1. 5'-вырожденные праймеры, использованные в ПЦ?
Встречае- Koличeствo
№ Праймер мость гекса- амплифици-
нуклеотида руемых
в мт ДЖ фрагментов
1 5'NNNNGCCCTT3' 272 7-10
2 5'NNNNGGAAAG3' 315 15-18
3 5'NNNNCTTTCC3' 2б9 10-15
4 5'NNNNCTTTCG3' 198 4-б
5 5'NNNNAAGGGG3' 152 15-17
б 5'NNNNGCTGCT 3' 1бб 20-23
7 5'NNNNCTCTTC3' 2б9 2-5
зации синтезировали методом статистической затравки на выделенных из геля с использованием иодистого калия продуктах ПЦР в качестве матриц.
RAPD-анализ с использованием 10-членных 5'-вырожденных праймеров проводили согласно [11]. ПЦР проводили на амплификаторе "Тер-цик" в 20 мкл реакционной смеси следующего состава: 67 мМ Трис-HCl, pH 8.9; 1.5 мМ MgCl2; 17 мМ (NH4)2SO4; 0.5% Tween 20; 0.5 мМ р-меркап-тоэтанол; по 200 мкМ каждого dNTP; 1.5 ед.акт. Гад-ДНК-полимеразы; по 16-80 мкМ вырожденного праймера; 100 нг мтДНК. Вырожденные праймеры синтезированы Д.В. Пышным (НИБХ, Новосибирск). Проводили по 25-30 температурных циклов: первая денатурация - 95°С, 2 мин, затем денатурация при 94°С, 15 с; отжиг праймеров -42°С-50°С, 25 с; элонгация цепи - 72°С, 45 с. Продукты амплификации выявляли после электрофореза в 1%-ном агарозном геле в буфере TAE (40 мМ Трис-ацетат pH 7.4; 2 мМ EDTA).
Клонотеку фрагментов митохондриального генома S-типа размером 8-12 т.п.н. после неполного гидролиза рестриктазой MboI получали в векторе pBluescriptIISK+ ("Stratagene", США) согласно [10]. Рекомбинантные плазмидные ДНК, содержащие нуклеотидные последовательности из района orf215, анализировали с использованием рестрик-таз BamHI, HindIII, XhoI согласно инструкциям фирмы-производителя ("Fermentas", Литва).
Праймеры для ПЦР-анализа гена rps3 (Р1-Р3) подбирали с помощью программы "Primer Premier" с использованием нуклеотидной последовательности митохондриального генома сахарной свеклы N-типа (GenBank Acc. № AP000396, AP000397) [12] и последовательности, определенной нами (см. раздел "Результаты исследования").
P1 - 5'-CGAGAAATTAAAGAGGCTTA-3',
P2 - 5'-TGTGGTCCTTATTGGGTG-3',
P3 - 5'-AGCAGGAACCTCACAAACC-3'.
Общий праймер Р1 (позиция 273627-273646 н. в последовательности AP000397) использовали в реакции амплификации вместе с праймерами Р2 (274312-274295 н. в этой же мтДНК) и Р3. В результате ПЦР на матрице мтДНК N-типа или на суммарной ДНК растений с N-типом митохондриального генома получали два фрагмента - 686 и 276 п.н. Амплификационная смесь содержала по 0.5 мкМ каждого праймера и 30-100 нг ДнК-матрицы. ПЦР проводили по следующей схеме: денатурация - 94°С, 28 с; отжиг праймеров - 50°С, 30 с; элонгация цепи - 72°С, 35 с, заключительная элонгация - 72°С, 2 мин. Продукт амплификации выявляли электрофорезом в 1%-ном агарозном геле в буфере tAe.
Продукты ПЦР клонировали в плазмиде pBlueScriptSK(+), отбирали рекомбинанты и выделяли рекомбинантную ДНК согласно [10]. Нуклеотидные последовательности клонированных фрагментов и продуктов ПЦР определяли на автоматическом секвенаторе ABI Prism 310 Genetic Analyzer с использованием набора BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit ("Perkin Elmer", США) согласно инструкциям производителя.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовали декануклеотидные праймеры, имеющие константный 3'-концевой гекса-нуклеотидный мотив и вырожденный тетрануклео-тидный 5'-концевой. Каждый праймер представляет собой смесь 256 (44) декануклеотидов. Специфичность отжига 5'-вырожденных праймеров определяется константным мотивом, а вырожденный мотив позволяет получить высокоинформативные ПЦР-фингерпринты при достаточно высоких температурах отжига (до 50°С). Гексамерные мотивы подбирали с помощью разработанной нами компьютерной программы, оценивающей встречаемость и распределение олигонуклеотидов определенной длины в заданной нуклеотидной последовательности [11]. С использованием этой программы мы проанализировали встречаемость всех возможных гексануклеотидных мотивов в мтДНК сахарной свеклы N-типа. Из гексануклео-тидов с GC-составом не ниже 50%, которые встречаются в геноме не менее 150 раз, для ПЦР произвольно отобрали семь (табл. 1).
В мтДНК, выделенной из четырех линий сахарной свеклы с цитоплазмой N-типа и четырех -с цитоплазмой S-типа, с помощью ПЦР с этими праймерами не обнаружили внутрилинейных различий, но выявили незначительные различия в мтДНК из линий с цитоплазмой одного типа и существенные различия между линиями с разным типом цитоплазмы (рис. 1). Десять основных полиморфных ПЦР-фрагментов использовали в качестве матрицы для синтеза радиоактивно меченных зондов. Пять зондов гибридизовались с
1 2 3 4 5 M 6 7
N
N
1 2 3 4 5 6 7 8 M
п.н.
2500 2000
1500 1000
750 500
Рис. 1. Различия между мтДНК различных линий сахарной свеклы. а - Полиморфизм мтДНК линий СОАН-31 (N-тип) (1-4), СОАН-252 (N-тип) (5, 6) и цмсСОАН-31^-тип) (7), выявлямый праймером 1 (номера праймеров здесь и далее соответствуют табл. 1). М - маркер длин фрагментов ДНК (1 kb ladder). Продукты ПЦР, специфичные для митохондри-ального генома N-типа, указаны стрелками. Электрофорез проводили в 1.5%-ном агарозном геле. б - Полиморфизм мтДНК изогенных линий СОАН-31 (N-тип) (1-4) и цмсСОАН-31 (S-тип) (5-8), выявляемый праймером 2. M - маркер длин фрагментов ДНК (1 kb ladder). Полиморфные продукты ПЦР указаны стрелками. Электрофорез проводили в 6%-ном поли-акриламидном геле.
мтРНК в цитоплазме N- и/или S-типа, при этом четыре зонда выявляли различия между цитоплазмой N- и S-типа. Для всех полиморфных продуктов ПЦР, гибридизующихся с мтРНК, опреде-
Рис. 2. Нозерн-блот-гибридизация мтРНК линий СОАН-252 (К-тип) и цмсСОАН-98 (Б-тип) сахарной свеклы с радиоактивно меченными зондами на основе ПЦР-фрагментов 181000 (а) и Ш1200 (б).
лены гомологичные им гены или открытые рамки считывания (табл. 2).
Найдены два маркера (Ш1200 и 1И2500), соответствующих новым структурным вариантам мтДНК, остальные участки перестроек охарактеризованы ранее [12]. Маркер Ш1200, который выявляет различия в профилях транскрипции ми-тохондриальных геномов в цитоплазме разного типа (рис. 2), содержит открытую рамку считывания orf215. Изменения
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.