ж
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1995, том 21, № 7, с. 483 - 491
УДК 577.152 361*313
СТРУКТУРНЫЙ АНАЛИЗ ИЗОФОРМ %а ,К -ЛТР-1пы
МОЗГА ТЕЛЕНКА
© 1995 г. Н. М. Владимирова*, Н. А. Потапенко, Н. Н. Модянов
Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117871, ГСП-7, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Поступила и редакцию 20.07.94 г. После доработки 03.10.94 г.
Определены изоформный состав, тип функционирующих комплексов Ма+,К+-АТР-азы в ряде мембран мозга теленка и константы ингибирования их уабанном. Выявлена повышенная чувствительность к эндогенному протеолизу каталитической субъединицы ей в составе нативного ферментного комплекса. Локализована точка специфического протеолиза в области нолипеггтидной цепи, уникал ь-ной для всех изоформ типа аЗ: РЖ)>ГК492 4 (У493) (по нумерации аЗ-субъединицы человека). Впервые показано, что во всех препаратах фермента, содержащих а.2- и «3-изоформы, выделенных как по методу Иоргенсена, так и по методу Эсмана, присутствуют два других белка - |35-цепь тубулина и глицер-альдегид-3-фосфат-дегидрогеназа, биологический смысл ассоциации которых пока неясен.
Ключевые слова: ,К+-АТГ-аза; изоформы; изоферменты.
С помощью биохимических, иммунохимичес-ких и генетических методов открыты семейства изоформ для обеих субъединиц 1Ча+,К+-АТР-азы: каталитической а (М ~ 100 к Да), содержащей все известные в настоящее время функциональные домены, и гликопротеина ¡3 (М~ 50 кДа, белковая часть - М ~ 35 кДа) (см. обзоры [1, 2]).
I
В настоящее время для каталитической субъ-гдиницы показано наличие трех из( )фо] а («], ой И аЗ), являющихся продуктами различных генов [3]. Распределение изоформ носит ткане- и клеточно-специфический характер и может быть очень сложным в клетках, плазматические мембраны которых организованы в домены с различной морфологией и функцией [4].
Семейство изоформ для гликозилированной субъединицы Ка+,К+-АТР-азы представлено в настоящее время также тремя типами - (31, [32 и (33 [3].
В результате открытия семейства генов, кодирующих различные изоформы субъединиц Ка+,К+-АТР-азы, возникла проблема выделения функционально активных изоферментов и изучения их функциональных особенностей. Физиологическая ассоциация специфической [3-из о формы со специфической а-изоформой была продемонстрирована лишь на нескольких примерах. Наиболее изучен ферментативный комплекс а1)31, выделенный из почек [2, 3]. Именно на таком
* Автор для переписки. Сокращения: ОЩР- диизопропилфторфосфат; СрА - кар-боксипептидаза А; СрВ - к а р б о к си пептид а а В; РУПР-мем-брана - шшивипилидепдифторид-мембрана.
ферменте были получены экспериментальные данные о топографии субъединиц, представление о локализации всех функционально важных доменов каталитической субъединицы [2,3]. В ооцитах обнаружены только мРНК а.1 и (33, что предполагает присутствие гетеродимера а!{33 [3], однако фермент соответствующего типа не выделен. Есть также косвенные доказательства, что ге-теродимеры а.2[32 в глиальных клетках [5] и а3|32 в фоторецепторных клетках [6] также физиологичны. И, наконец, неизвестно, продуцируются ли различные гетеродимеры в клетках одного вида. В мозге синтезируются все обнаруженные к настоящему времени изоформы каталитической и гликозилированной субъединиц [2, 7]. Ма+,К+-АТР-аза находится в высоких концентрациях как в нейронах, где осуществляет сложный и топкий контроль ионного окружения, важный для генерации нервного импульса, так и в глиальных клетках, которые участвуют в регулировании концентрации экстраклеточного калия, происходящем вслед за активацией нерва.
Целью данной работы являлись поиск и характеристика белковых продуктов экспрессии генов субъединиц Ка+,К+-АТР-азы, определение их тканевого распределения, изучение изоформно-го и изоферментного состава №\К+-АТ'Р-азы в тканях мозга, где присутствуют несколько изоформ; выяснение функциональных и структурных особенностей ферментов, содержащих в качестве каталитической субъединицы различные типы изоформ.
Необходимым этапом данного исследования являлась разработка методов выделения функционирующих комплексов Na+,K+-ATP-a3bi мозга из мембран различных типов клеток мозга.
В качестве объектов исследования нами были выбраны серое вещество коры, содержащее клетки глии, и ствол мозга теленка, богатый мие-линизированными аксонами. Ствол служил также исходным материалом для получения аксо-леммы. Выделение и характеристика полученного микросомного материала подробно описаны в нашей предыдущей работе [8].
Несмотря на интенсивное использование различных детергентов при очистке, солюбилизации и реконструкции 1Ма+,К+-АТР-азы [9, 10], пока еще мало проведено исследований, касающихся возможных причин и механизмов их влияния на функциональные свойства насоса. Оптимальные условия получения №1+,К+-АТР-азы из различных тканей, как правило, подбираются эмпирически. Критериями чистоты и целостности фермента чаще всего служат данные электрофоретическо-го контроля и АТР-азная активность. Однако, изучая чувствительность к катионам для одних и тех же изоформ высокоочищенных препаратов ферментов, различные авторы получили противоречивые результаты (см. обзор [II]). Оказалось, что сродство к катионам и другие характеристики изоформ in vitro зависят как от источника получения фермента, так и от протокола его очистки [11]. По-видимому, нельзя исключить влияние различий в липидном микроокружении и цитоскелетной структуре на функциональные свойства фермента.
Для выделения Na+,K+-ATP-a3bi из мозга теленка нами было решено использовать два принципиально различных методических подхода: а) селективное удаление примесных белков по методу Йоргенсена [12], где Na+,K+-ATP-a3a остается мем-браносвязанной; б) селективную солюбилизацию фермента с помощью детергента С^Ь^ с последующей реформацией мембранной структуры в присутствии ионов Мп2+ по методу Эсмана [13].
Метод Йоргенсена был основным при выделении Ыа+,К+-АТР-азы из почек животных. После обработки мембран с помощью SDS (в присутствии АТР) и последующего зонального центрифугирования солюбилизированного материала были получены препараты фермента с наибольшими значениями специфической удельной АТР-азной активности и степени очистки [12]. В нем на долю а-субъединицы приходится около 67 - 70% белка. Отсутствие примесных белков в ферменте было также показано при анализе пептидов, полученных в результате исчерпывающего гидролиза экспонированных доменов мембраносвязанного фермента: в гидролизате присутствовали пептиды только а- и р-субъединицы [14]. Метод
Йоргенсена был также успешно применен для выделения фермента из аксолеммы ствола мозга крысы. Препарат содержал в качестве каталитической субъединицы а+ (по иммунохимическому анализу смесь а2 и аЗ), по активности он был сравним с ферментом, полученным из почек [15]. Однако, по данным электрофореза, даже в самом чистом образце фермента, выделенном из аксолеммы по методу Йоргенсена, в отличие от фермента, выделенного из почек, полоса с М ~ 46 кДа содержала ß-субъединицу Na+,K+-ATP-a3bi (не-охарактеризованную изоформу) и некий примесный белок близкой молекулярной массы [15], которые, к сожалению, не были идентифицированы. Успех выделения фермента по методу Йоргенсена из гомогената мембран мозга сильно зависел от АТР-азной активности микросомного материала, способа его получения, а конечный изоформный состав Na+,K+-ATP-a3bi изменялся в зависимости не только от выбора способа получения микросомного материала, но и от объекта исследования [15]. Так, препарат фермента, выделенный из аксолеммы ствола мозга собаки, в отличие от аналогичного препарата, выделенного из мозга крысы, содержал наряду с а+- также а!-изоформу.
Метод Эсмана [13] был предложен для очистки Na+,K+-ATP-a3 из мембран пластинок электрических органов и ректальных желез колючей акулы Squalus acathias, где метод Йоргенсена оказался неприменим вследствие вызываемой SDS инактивации ферментов. После обогащения препаратов с помощью обработки мембран дезокси-холатом и специфической солюбилизации детергентом С12Е8 фермент был осажден в мембранной форме с помощью двухвалентных ионов Са2+ или Мп .
Выделение ферментов из всех трех видов мик-росом было осуществлено нами двумя описанными выше методами/Подбор оптимальных условий обработки микросом детергентами и методология выделения ферментов подробно описаны в работе [8].
Как уже упоминалось выше, традиционно применяемыми критериями очистки являются элект-рофоретическая чистота и специфичная удельная активность фермента. Электрофоретический анализ Na+,K+-ATP-a3bi из серого вещества показал, что фермент, выделенный двумя методами, имеет примерно одинаковую степень чистоты [8]. При сравнении электрофореграмм ферментов, выделенных нами по методу Йоргенсена из серого вещества мозга теленка и наружных медул почек свиньи (рис. 1, дорожки 1 и 5), видно, что ß-субъединица серого вещества проявляла большую электрофоретическую подвижность по отношению к ß-субъединице из почек свиньи, тогда как подвижность каталитических субъединиц обоих препаратов была одинакова.
СТРУКТУРНЫЙ АНАЛИЗ ИЗОФОРМ Na , К -АТР-азы
485
1 2 3 4 5
сгарт
кДа
-94
|район а
ро-
3-
4-
-67 -43
район ¡3
-30
Рис. I. Электрофореграммы ферментов: 1 - АТР-аза серого вещества коры, обработанная 01РР; 2,3 - АТР-аза аксо-леммы ствола до (2) и после (3) обработки 1)НР;</-А ТР-аза ствола после обработки 01РР; 5-контроль (АТР-аза мозгового слоя почек свиньи, выделенная нами по методу Йоргенссна и описанная в работе £14]). Образец Лвыделен по методу Иоргенсена, образцы 2-4 выделены по методу Эсмана. Стрелками слева обозначены полосы геля, содержащие белки, подвергнутые последующему структурному анализу, описанному в тексте.
Интерпретация результатов электрофорети-ческого анализа Na+,K+-ATP-a3bi из микросом ствола и его аксолеммы оказалась довольно сложной. Во-первых, у одного и того же препарата фермента электрофореграммы различались в зависимости от условий обработки образца и проведения электрофореза - увеличение рН буфера (7.2 —•>■ 9.3) и мягкая тепловая обработка (37°С, 10-15 мин) приводили к
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.