ГЕНЕТИКА, 2008, том 44, № 12, с. 1638-1643
ГЕНЕТИКА РАСТЕНИЙ
УДК 576.3:577.151.64:633.413
СУБКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ ИЗОФЕРМЕНТОВ НАД-ЗАВИСИМОЙ МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ (Beta vulgaris L.)
© 2008 г. Р. С. Юдина, Е. В. Левитес
Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск 630090;
e-mail: levites@bionet.nsc.ru Поступила в редакцию 04.04.2007 г.
Исследована субклеточная локализация изоферментов НАД-зависимой малатдегидрогеназы (МДГ) сахарной свеклы. Показано, что изоферменты ss и ll, контролируемые соответственно локусами Mdh2 и Mdh3, находятся в митохондриях, а изофермент pp, контролируемый локусом Mdhl, - в микросомах. Во всех исследованных образцах отсутствуют гибридные изоферменты МДГ, которые могли бы свидетельствовать о взаимодействии продуктов неаллельных Mdh генов. Это может быть объяснено локализацией неаллельных изоферментов в разных компартментах клетки и органелл.
Малатдегидрогеназа (МДГ, К.Ф. 1.1.1.37) относится к числу наиболее изученных ферментов у растений. По своей четвертичной структуре МДГ -димер [1-3]. Генетический контроль МДГ к настоящему времени изучен более чем у 20 видов растений [1-3]. Показано, что у растений этот фермент контролируется несколькими локусами, которые определяют образование изоферментов МДГ, различающихся своей внутриклеточной локализацией и электрофоретической подвижностью. У кукурузы выявлены четыре формы МДГ: цитоплазматическая, митохондриальная, глиоксисомальная и хлоропластная [4]. Митохон-дриальные, микротельцовые и растворимые изоферменты МДГ обнаружены в листьях шпината
[5]. Идентифицированы митохондриальные и растворимые изоферменты МДГ у арабидопсиса
[6]. Выявлены и изучены глиоксисомальные и митохондриальные формы МДГ из семядолей арбуза [7, 8]. Предполагается, что число неаллельных вариантов изоферментов, локализованных в субклеточных органеллах, соответствует числу типов субклеточных компартментов, для которых требуется одна и та же каталитическая реакция [9]. Число изоферментов в спектре МДГ определяется генотипом растения. У гомозигот число изоферментов МДГ равно числу неаллельных генов ЫйН, проявляющих активность в исследуемой ткани. У гетерозигот число изоферментов МДГ больше за счет наличия аллельных гомодимеров и образования гетеродимеров [1-3, 10].
В изоферментном спектре НАД-зависимой МДГ сахарной свеклы выявляются две основные анодные зоны ферментативной активности: быстромигрирующая (зона I) и медленномигри-рующая (зона II), контролируемые полиморфными неаллельными генами, соответственно Мог1 и
Mor2 [10]. В зоне I выявляются также продукты мономорфного локуса, обозначенного Mor3 [1, 11]. Впоследствии эти обозначения были заменены наиболее употребительными Mdhl, Mdh2 и Mdh3 [12]. Полиморфизм МДГ в зоне I представлен тремя типами спектров: однополосными спектрами, соответствующими гомозиготам Mdhl-N/Mdhl-N и Mdhl-P/Mdhl-P, и трехполосным спектром, соответствующим гетерозиготам Mdhl-N/Mdhl-P. Наличие трех изоферментов у гетерозигот обусловлено тем, что в клетке синтезируются продукты обоих аллелей. Аллельные субъединицы фермента свободно ассоциируют друг с другом, благодаря чему в клетке происходит образование двух типов гомодимерных изоферментов и один тип гетеродимерных молекул -гибридный изофермент, который располагается на равном удалении между аллельными гомоди-мерами. Наличие гибридного изофермента является доказательством димерной природы малат-дегидрогеназы.
Аналогичный механизм лежит в основе полиморфизма МДГ, выявляемого в зоне II [10]. Все типы спектров МДГ в зонах I и II независимы. Именно это является доказательством того, что изоферменты МДГ этих зон контролируются неаллельными генами. В спектре МДГ сахарной свеклы не содержатся гибридные (гетеродимер-ные) изоферменты, которые могли бы включать в себя субъединицы, контролируемые неаллельными генами. Этот факт очень важен для характеристики фермента. Принято считать, что отсутствие гибридизации между неаллельными формами некоторых ферментов может быть обусловлено либо резкими различиями в первичной структуре субъединиц фермента, либо локализацией изоферментов в разных компартментах
1638
клетки [13, 14]. В связи с этим представляло интерес изучение внутриклеточной локализации изо-ферментов МДГ у сахарной свеклы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве материала использовали растения инбредных линий сахарной свеклы из коллекции лаборатории популяционной генетики растений Института цитологии и генетики СО РАН. Растения выращивали в гидропонной теплице. Исследования проводили на молодых листочках 14-18-дневных растений и на листьях взрослых растений. Вымытые листья измельчали ножницами на мелкие кусочки. Все последующие операции проводили при температуре 0-+4°С. Гомогенизацию осуществляли двумя способами: а) в микрораз-мельчителе РТ-2 и б) с помощью пестика в ступке. Состав среды для суспендирования также варьировали: либо использовали 0.25-0.5 М сахарозу, либо комбинацию 0.25 М сахарозы с 0.25 М маннитом. (Во всех случаях результаты разделения органелл были одинаковы.) Среда для суспендирования содержала 15 мМ КН2РО4, 5 мМ ЭДТА, рН 7.5. После гомогенизации полученную суспензию отжимали через четыре слоя капрона и ее рН доводили до 7.5 с помощью 1 М КОН. Сок центрифугировали при ступенчатом увеличении центробежного ускорения. Первое центрифугирование проводили при 1000 g для удаления из гомогена-та ядерной и хлоропластной фракций. Супернатант, полученный после первого центрифугирования, подвергали повторному центрифугированию в течение 20 мин при 15000 об/мин (10000 g) для осаждения митохондриальной фракции. Полученный таким путем осадок, содержащий в основном митохондрии, дважды промывали вышеуказанным буфером путем ресуспендирования и центрифугирования при 13000 об/мин. Супернатант, полученный после отделения митохондрий, центрифугировали при 37000 g (20000 об/мин) в течение 20 мин для получения микросомальной фракции. Полученный осадок также промывали путем ресуспендирования и центрифугирования. Суперна-тантную жидкость после третьего центрифугирования обозначали как "растворимую" фракцию. Ресус-пендированные осадки (второй и третий) наслаивали на поверхность сахарозного градиента и центрифугировали в течение 3-4 ч при 25000 об/мин на центрифуге УАС-602 с бакет-ротором. Сахарозный градиент готовили последовательным внесением в центрифужную пробирку шприцем растворов сахарозы различной плотности, имеющих концентрации: 1.8 М (4 мл), 1.58 М (5 мл), 1.37 М (6 мл), 1.0 М (6 мл) и 0.65 М (5 мл). В отдельных экспериментах для создания самой низкой концентрации использовали 0.25 М раствор сахарозы. Условия дифференциального центрифугирования и сахарозный градиент подбирали с учетом
рекомендаций, указанных в литературе [5, 15-18]. По окончании центрифугирования слои клеточных органелл, расположенные в зонах сахарозы с различной плотностью, отбирали шприцем последовательно, разжижали фосфатным буфером до концентрации сахарозы 0.25 М и снова центрифугировали при 15000 об/мин около 20 мин. Полученные осадки клеточных органелл ресуспен-дировали, часть каждого обрабатывали тритоном Х-100 и анализировали электрофоретически. Для электрофоретического разделения изоферментов малатдегидрогеназы применяли стандартный метод горизонтального электрофореза в 14%-ном крахмальном геле в трис-цитратной буферной системе, предложенной Мейзелем и Маркертом [19], с последующим гистохимическим выявлением активности изоферментов на электрофореграммах. Гелевый буфер (рН 7.0) содержал 0.0125 М трис и 0.0041 М лимонную кислоту, а электродный буфер (рН 7.0) содержал те же самые компоненты, но в более высокой концентрации: 0.0375 М трис и 0.0125 М лимонную кислоту. Продолжительность электрофореза составляла 16 ч при напряжении постоянного тока 90 В. После обнаружения на электрофореграммах малатдегидроге-назной активности оставшуюся часть каждого из осадков фиксировали 1%-ной тетраокисью осмия в течение 30 мин, обезвоживали в серии спиртов восходящей концентрации с заменой абсолютного этанола на абсолютный ацетон и заливали в аралдит по общепринятой методике. Ультратонкие срезы просматривали в электронном микроскопе ШМ-100 С.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Число изоферментов НАД-зависимой МДГ у различных растений сахарной свеклы колеблется от 3 до 7 в зависимости от генотипа растения [11]. В данном эксперименте использовали растения линии сахарной свеклы П-40-(п), с генотипом МйМ-Р/МйМ-Р\ МёН2-8/МёН2-8; МйН3-Ь/МйН3-Ь (сокращенно РРББЬЬ). У растений такого генотипа в спектре МДГ содержатся три изофермента: из них в зоне I выявляются изоферменты рр и 11, контролируемые соответственно локусами МйЫ и МдкЗ, а в зоне II присутствует изофермент 88, контролируемый локусом МйН2 (рис. 1).
На рис. 2 представлены изоферментные спектры субклеточных фракций из экстракта молодых листьев сахарной свеклы после центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. В неочищенном гомогенате (рис. 2, 1), так же как и в растворимой фракции (рис. 2, 2), содержатся все три изофермента: рр, 88 и 11. В то время как во фракции, взятой с верхнего слоя градиента, имеющего низкую концентрацию сахарозы (0.251.0 М) и расположенного от поверхности до границы с более плотной сахарозой (1.0 М), присут-
1640
ЮДИНА, ЛЕВИТЕС
ss
II
РР ll
Рис. 1. Изоферментный спектр малатдегидрогеназы (МДГ) в листьях растений сахарной свеклы линии П-40-(п) генотипа МйЫ-Р!МйЫ-Р, Мйй2-5/Мйй2-5, МйНЗ-ЦМйНЗ-Ь. I и II - зоны активности фермента. 0 - старт, + - анод.
ствуют изоферменты pp и ss и лишь следы изофермента ll (рис. 2, 3). Эта фракция неоднородна по субклеточному составу, содержит митохондрии различных размеров и значительное количество мелких структур, которые мы обозначили как микросомы (рис. 3). Во фракции органелл, сконцентрированных в еще более плотной сахарозе (1.37 М), наблюдается иная картина: присутствуют изоферменты ll и ss, а изофермент pp выявляется довольно слабо (рис. 2, 4). В изофер-ментном спектре, выявленном во фракции, снятой с сахарозного слоя концентрации 1.58 М, картина еще более резкая: изофермент pp практически
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.