ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2009, том 426, № 1, с. 122-126
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.152.3
СУБСТРАТНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ ТИХООКЕАНСКОГО КАЛЬМАРА ТОБАКОБЕ8 РАСШСШ © 2009 г. Е. В. Розенгарт, Н. Е. Басова
Представлено академиком В.Л. Свидерским 20.09.2008 г. Поступило 28.10.2008 г.
Субстратная специфичность является важнейшей энзимологической характеристикой всех ферментов и особенно таких, как холинэстеразы (ХЭ), у которых чрезвычайно широк набор исследованных субстратов, являющихся в основном синтезированными эфирами, и имеется у ХЭ только один природный субстрат ацетилхолин (АХ) [1]. На самом деле понятие субстратной специфичности включает разные аспекты реакционной способности ХЭ [2, 3]. Тем не менее на первом месте стоит зависимость кинетических параметров процесса ферментативного гидролиза от различных элементов структуры сложноэфир-ных субстратов. Это подразумевает структурные вариации как в кислотной, так и в спиртовой частях субстратной молекулы [1, 2, 4], что дает информацию о процессах ориентированной сорбции, об особенностях конфигурации мест сорбции и о продуктивной конформации субстратов [1, 5]. Подобный субстратный анализ касается в полной мере реакционной способности двух "реперных" препаратов ХЭ - ацетилхолинэстеразы эритроцитов человека (АХЭ) и бутирилхолинэстеразы сыворотки крови лошади (БхЭ) [1]. В последние десятилетия достаточно подробно изучены препараты ХЭ других наземных животных и гидро-бионтов [1, 6, 7]. Все это придало холинэстеразным исследованиям сравнительно-энзимологический аспект [1] и позволило использовать параметры реакционной способности ХЭ в предложенном нами биохимическом способе определения таксономической принадлежности головоногих гидробионтов [8, 9].
В настоящей работе проведен сравнительный анализ субстратной специфичности ХЭ зрительных ганглиев тихоокеанского кальмара Тоёагоёев расШсш и "реперных" АХЭ и БХЭ, а также сопоставление ХЭ с ХЭ ряда других кальмаров.
В качестве источников ферментов использовали центрифугат (800 g, 15 мин) водного гомоге-
ната (3 мг/мл) тканей зрительного ганглия тихоокеанского кальмара Тоёагоёев расШсш [2, 6]. Каталитическую активность ферментов определяли либо потенциометрически (субстраты - эфиры карбоновых кислот) [6], либо колориметрически методом Эллмана (субстраты - эфиры тиокарбо-новых кислот) [10], либо спектрофотометриче-ски (субстраты - индофениловые эфиры) [6, 11]. Формулы и названия изученных субстратов приведены в табл. 1 [1, 2, 6].
Ранее [12, 13] была отмечена в тканях зрительного ганглия тихоокеанского кальмара Т. расШсш, только холинэстеразная активность, что доказано методом субстратно-ингибиторного анализа с использованием трех субстратов и пяти фосфорорга-нических ингибиторов различной структуры (табл. 2), включая специфические эффекторы БХЭ (БХ и соед. 1) и АХЭ (АМХ и соед. 2). Как видно из табл. 2, величина кп для каждого из изученных ингибиторов практически не зависела от природы субстрата. Таким образом можно говорить с большой долей вероятности, что ткань зрительного ганглия тихоокеанского кальмара Т. расШсш содержит только одну ХЭ, обладающую своеобразной субстратной и ингибиторной специфичностью [1, 2, 6]. Согласно [6] тихоокеанский кальмар в северо-западной акватории Тихого океана образует сезонные популяции. Из данных табл. 2 следует, что у разных особей из этих популяций в тканях зрительного ганглия не только сохраняется активность одной только ХЭ, но и чувствительность ко всем изученным ингибиторам была совершенно одинаковой, что свидетельствует об идентичности свойств ХЭ разных особей Т. расШсш.
В табл. 3 суммированы кинетические параметры гидролиза субстратов различной структуры (табл. 1) под действием ХЭ тихоокеанского кальмара Т. расШсш. Для сравнения приведены данные по гидролизу этих эфиров под действием АХЭ эритроцитов человека и БХЭ сыворотки крови лошади. В гомологическом ряду холино-вых эфиров от формоилхолина (ФХ) до валерил-холина (ВХ) наблюдалось монотонное снижение скорости гидролиза. Величина ас/Км, в опреде-
Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова
Российской Академии наук, Санкт-Петербург
Таблица 1. Формула и название субстратов
Сокращение Формула Название
ФХ АХ ПХ БХ ВХ иБХ ААХ КХ АМХ НС(0)0СН2СН21 (СН3)3 ■ Х-СН3С(0)0СН2СН21 (СН3)3 ■ Х-С2Н5С(0)0СН2СН21 (СН3)3 ■ Х-С3Н7С(0)0СН2СН21 (СН3)3 ■ Х-С4Н9С(0)0СН2СН21 (СН3)3 ■ Х-(СН3)2СНС(0)0СН2СН21 (СН3)3 ■ Х-СН3С(0)СН2С(0)0СН2СН21 (СН3)3 ■ Х-СН3СН=СНС(0)0СН2СН21 (СН3)3 ■ Х-СН3С(0)0СН(СН3)СН21 (СН3)3 ■ Х- Формоилхолин Ацетилхолин Пропионилхолин Бутирилхолин Валерилхолин Изобутирилхолин Ацетоацетилхолин Кротонилхолин Ацетил-р-метилхолин
АП АТХ ПТХ БТХ АТМХ ФА СИ3С(0)0СИ2СИ2-1Ч_^ ■ Х- СНз СН3С(0)8СН2СН21+(СН3)3 ■ Х-С2Н5С(0)8СН2СН21 (СН3)3 ■ Х-С3Н7С(0)8СН2СН21 (СН3)3 ■ Х-СН3С(0)8СН(СН3)СН21 (СН3)3 ■ Х-СН3С(0)0С6Н5 Ацетоксиэтил-К-метил-пиперидиний Ацетилтиохолин Пропионилтиохолин Бутирилтиохолин Ацетилтио-р-метилхолин Фенилацетат
ИФА СНзС(0)0^]Ъ10о Индофенилацетат
ДИФА а /=\сНз СИзС(0)0^^1^^)=0 С1 2,6-Дихлорфенолиндофенилацетат
ДИКА 2,6-Дихлорфенолиндо-о-крезилацетат
ленной мере характеризующая начальную стадию сорбции субстрата [1, 6], была аномально низкой у ФХ. Функциональные изменения в ацильной цепи: разветвление [изобутирилхолин (иБХ)], введение карбонильной группы [ацетоацетилхолин (ААХ)] или двойной связи [кротонилхолин (КХ)] также сопровождались резким снижением скорости гидролиза. В случае тиохолиновых производных зависимость скорости гидролиза от структуры ацильной группы как внутри ряда, так и при сравнении с кислородными аналогами была значительно менее выраженной. Неожиданным оказался эффект введения метильной группы в холиновую часть молекулы эфира: ацетил-р-метилхолин (АМХ) гидролизовался немногим медленнее, чем АХ, но при этом имел в 25 раз более низкую величину ас/КМ, а ацетилтио-0-метилхолин (АТМХ) оказался лучшим из исследованных субстратов
ХЭ кальмара, почти в 2 раза превосходя по скорости гидролиза ацетилтиохолин (АТХ) и АХ. Замена в молекуле АХ триметиламмониевой группировки на К-метилпиперидиниевую [ацетоксиэтил-К-ме-тил-пиперидиний (АП)] сопровождалась почти 4-кратным снижением скорости гидролиза. Среди гидрофобных, не содержащих катионной группировки субстратов, только фенилацетат (ФА) гидролизовался в 1.5 раза быстрее, чем АХ, правда при существенно (в 10 раз) более низкой величине ас/Км. Скорость гидролиза индофениловых производных была существенно ниже.
Таким образом, при сравнительном анализе величин кинетических параметров гидролиза различных по структуре субстратов под действием ХЭ кальмара и млекопитающих можно прийти к ряду заключений. Во-первых, ХЭ кальмара обладает широким спектром субстратной специфич-
Таблица 2. Проверка методом субстратно-ингибиторного анализа холинэстеразной активности в зрительных ганглиях особей тихоокеанского кальмара Т. расШсш разных сезонных популяций (антихолинэстеразная эффективность кп) [12, 13]
Осенняя популяция
Зимняя популяция
Фосфорорганический ингибитор субстрат
АХ БХ АМХ АХ БХ
1. [(СИ3)2СИ0]2Р(0)Р 6.84 6.86 6.89 6.85 4.88
2. С2И50(СИ3)Р(0)8С2И48 (СИ3)С2И5 7.64 7.56 7.50 7.64 7.56
3. С2И50(СИ3)Р(0)8С2И4СИ(СИ3)2 5.65 5.79 5.63 5.66 5.82
4. С4И90(СИ3)Р(0)8С2И48С2И5 7.71 7.89 7.73 7.76 7.90
5. [(СИ3)3ССИ(СИз)0](СИз)Р(0)8С2И48С2И5 4.53 4.56 - 4.53 4.53
Примечание. Формулы и названия субстратов представлены в табл. 1, то же для табл. 3 и 4.
Таблица 3. Кинетические параметры субстратной специфичности (активность каталитического центра ас, мин-1; отрицательный логарифм константы Михаэлиса рКМ; ас/КМ, М-1 ■ мин1) холинэстеразы тихоокеанского кальмара Т. расШсш, КХЭ, АХЭ эритроцитов человека и бутирилхолинэстеразы сыворотки крови лошади (БХЭ) [1]
Субстрат ас, 104 ркм ас/Км ■ 10-8
КХЭ АХЭ БХЭ КХЭ АХЭ БХЭ КХЭ АХЭ БХЭ
ФХ 14 (-) 25 12 2.36 2.96 1.77 0.3 2 0.1
АХ 11 (+) 38 6.5 4.35 3.82 2.96 20 20 0.6
ПХ 8.9 (-) 26 13 4.00 3.82 3.00 9 15 10
БХ 7.2 (+) 0 18 4.11 - 3.00 10 0 0.2
иБХ 3.0 (+) 15 6.9 4.62 4.00 3.21 10 15 0.1
ААХ 2.3 (+) 0 - 4.37 - - 5 0 -
ВХ 0 0 1.9 - - 3.70 0 0 0.1
КХ 0 0 1.2 - - - 0 0 -
АМХ 9.2 (+) 10 0.32 2.92 2.92 2.89 0.8 0.8 0.03
АТХ 11 (+) 32 3.8 4.18 4.12 3.70 20 40 2
ПТХ 10 (-) 18 6.0 4.20 4.11 3.89 15 25 5
БТХ 9.0 (-) 1.6 8.5 4.09 - 3.77 10 - 5
АТМХ 19 (-) 21 6.5 3.82 4.22 3.77 15 35 4
АП 2.9 (+) 19 0.30 4.05 3.30 4.40 3 4 0.8
ФА 16 (-) 31 9.0 3.05 3.60 2.44 2 10 0.3
ИФА 1.5 (-) 5.0 0.30 3.38 3.24 3.10 0.4 0.9 0.03
ДИФА 0.80 (-) 4.0 0.90 3.89 3.62 3.80 0.6 2 0.6
ДИКА 0.14 (-) 2.1 0.20 3.70 3.40 4.00 0.07 0.5 0.2
Примечание. Торможение избытком субстрата: есть (+), нет (-) [1, 14].
ности, напоминая в большей степени БХЭ, чем АХЭ. Во-вторых, по гидролитической эффективности ХЭ кальмара занимает промежуточное положение между АХЭ и БХЭ. В-третьих, ХЭ кальмара проявляет свойственную АХЭ подверженность торможению ферментативной активности высокими концентрациями (избытком) субстрата [14], однако это наблюдалось не для всех холиновых эфиров, не говоря уже о гидрофобных субстратах. В-четвертых, у ХЭ кальмара зависимость "структу-
ра-активность" для отдельных групп субстратов отличалась иногда от АХЭ, иногда от БХЭ, а иногда от них обеих. Тем самым в качестве общего вывода можно постулировать своеобразие субстратной специфичности ХЭ тихоокеанского кальмара Т. расШсш.
В табл. 4 приведены данные по холинэстеразной активности препаратов тканей зрительных ганглиев разных видов кальмаров по отношению к сложноэфирным субстратам: ацильным эфи-
Таблица 4. Субстратная специфичность холинэстеразной активности ткани зрительных ганглиев различных видов кальмаров [6, 12, 13]
Удельная активность (У), мкмоль/мин ■ мг при [Si]0 и Уотн (вторые строки)
Вид кальмаров и район обитания
субстрат
AX пх БХ AMX АП
Todarodes pacificus
(Курило-Хоккайдский район Тихого океана)
осенняя популяция 0.56 0.45 0.34 0.27 0.21
100 80 60 50 35
зимняя популяция 0.56 0.50 0.39 0.30 0.23
100 90 70 55 40
Todarodes angolensis
Район о. Новая Зеландия 1.41 1.10 1.06 1.32 -
100 80
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.