БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1995, том 21, № 10, с. 781 - 789
УДК 577.152.277.153 ■
СУБСТРАТНЫЕ СВОЙСТВА ДИОКСОЛАНОВЫХ АНАЛОГОВ 3-ДЕЗОКСИТИМИДИН-5'-ТРИФОСФАТА В РЕАКЦИЯХ СИНТЕЗА ДНК, КАТАЛИЗИРУЕМЫХ РАЗЛИЧНЫМИ ДНК-ПОЛИМЕР АЗАМИ
© 1995 г. Е. В. Ефимцева, С. Н. Михайлов#, Л. С. Викторова, Т. А. Розовская*, Р. Ш. Бибилашвили*
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 117984, Москва В-334, ул. Вавилова, д. 32;
* Институт экспериментальной кардиологии Кардиологического научного центра РАМН, Москва
Поступила в редакцию 26.12.94 г. ;
Исследованы субстратные свойства аналогов 3'-дезокситимидин-5'-трифосфата на основе 2,4-диза-мещенных 1,3-диоксоланов в реакциях синтеза ДНК, катализируемых различными ДНК-полимера-зами. Показано, что 4'-трифосфаты (±)-г<ггс-4-гидроксиметил-2-(тимин-1-илметил)-1,3-диоксолана и соответствующего (+)-тря«с-изомера являются терминирующими субстратами концевой дезок-синуклеотидилтрансферазы. Также оказалось, что 4'-трифосфат (±)-1<мс-4-гидроксиметил-2-(ти-мин-1-илметил)-1,3-диоксолана терминирует синтез ДНК, катализируемый обратной транскрипта-зой ВИЧ, а 2'-трифосфат (±)-цис-2-гидроксиметил-4-(тимин-1-илметил)-1,3-диоксолана является терминатором в синтезе ДНК, катализируемом обратной транскриптазой ВИЧ и фрагментом Кле-нова ДИХ-полимеразы I.
Ключевые слова: транскриптаза.
аналоги
3'-дезокситимидин-5'-трифосфата, ДНК-полимер азы, обратная
В последние годы было показано, что аналоги 2',3'-дидезоксинуклеозидов, содержащие вместо фуранозного цикла диоксолановый (I) и (II), являются ингибиторами репликации ВИЧ [1 - 3]. Нами были получены родственные соединения на основе (±)-цис- и транс-4-гидроксиметил-2-метил-1,3-диоксолана (III) и (IV), имеющие конфигурацию, подобную как ß-, так и а-нуклеозидам [4, 5]. От ранее описанных аналогов нуклеозидов они отличаются наличием дополнительной СН2-группы между гетероциклическим основанием и диоксо-лановым фрагментом.
жн в Н0^0
o—f о—А
RO
(I)
г-В (III) R = Н
О—'в
(II)
RO-
°2' В
(IV)
(V) R = Р309Н4, В = Thy (VI)
Использованные обозначения: скГГТР - З'-дезокситимидин-5'-трифосфат, сШТТР(З'Р) - 3'-фтор-3'-дезокситимидин-5'-трифосфат, скГГЩЗ'ЫНз) - 3'-амино-3'-дезокситимидин-5'-трифосфат, ВИЧ - вирус иммунодефицита человека. # Автор для переписки.
Настоящая работа посвящена синтезу аналогов 2',3'-дидезоксинуклеозидов (X), (XI) на основе (:±)-цис- и (±)-т/?янс-2-гидроксиметил-4-метил-1,3-диоксолана и изучению субстратных свойств трифосфатов (V), (VI) (В = Thy) [4] и (XV) в реакциях синтеза ДНК, катализируемых ДНК-поли-меразами из различных источников.
Получение аналогов нуклеозидов на основе 2-гидроксиметил-4-метил-1,3-диоксолана представлено на схеме 1. Бензоилоксиацетальдегид (VII) получали периодатным окислением 1-бензоил-глицерина [6]. Реакция альдегида (VII) с 1-О-тозил-глицерином (VIII) [7] в присутствии катионооб-менной смолы (Н+-форма) приводила к ацеталю (IX) в виде рацемической смеси диастереомеров с общим выходом 57%. По данным 'Н-ЯМР-спект-ров, соотношение цис-/транс-изомеров оказалось близким к 1 : 1.
Алкилирование натриевой соли тимина този-латом (IX) приводило к образованию смеси N1,N3-6hc- и Nl-замещенных производных тимина, которые разделяли с помощью адсорбционной хроматографии на силикагеле [4]. Наибольшие трудности были связаны с разделением диастерео-мерных (±)-бензоильных производных (X) и (XI). Препаративную обращенно-фазовую хроматографию проводили на колонке, заполненной сорбентом Bondesil С18 в системе ацетонитрил-вода, 1:4.
BzO-
Bz0CH2CH=0 + CH,-CH-CH2OTs
i I I ¿
HO OH (VII) (VIII)
0
(IX)
CH,OTs
RO-
O
Thy
RO
2'
(X) (XII)
(XIV)
(XV)
+
o-
(XI) (XIII)
Thy
R = Bz R = H
R = P03H2 R = P309H4
Thy - тимидин-1 -ил
Схема 1.
При этом выделяли смешанную фракцию, которую затем повторно хроматографировали в тех же условиях. В результате выход цис- и транс-изомеров (X) и (XI) оказался невысоким. Дебен-зоилирование соединений (X), (XI) аммиаком в метаноле и последующая кристаллизация из этанола приводили к аналогам нуклеозидов (ХП) и (ХП1). УФ-спектры последних соответствовали спектрам природных Nl-тиминовых нуклеозидов. Препаративное разделение цис- и транс-изомеров возможно только в случае О-бензоильных производных, поскольку времена удерживания незащищенных нуклеозидов (XII) и (XIII) на сорбенте С18 практически одинаковы.
Структуру синтезированных соединений доказывали с помощью 'Н-ЯМР-спектроскопии. Однозначное определение конфигурации диастереоме-ров (X) и (XI) проведено с использованием метода разностной спектроскопии ядерного эффекта Оверхаузера [5]. Структура нуклеозидов (Ш), (IV) и (XII) была подтверждена также рентгенострук-турным анализом [8].
Тестирование синтезированных диоксола-новых аналогов нуклеозидов на клеточных культурах показало, что они не обладают цитотоксич-ностью и не проявляют активности против ВИЧ и вирусов группы герпеса [9]. Известно, что механизм антивирусного действия 2',3'-дидезоксинук-леозидов связан с их превращением клеточными киназами в соответствующие 5'-трифосфаты, которые, в свою очередь, ингибиругот вирусные обратные транскриптазы и ДНК-полимеразы. Отсутствие противовирусной активности и цитоток-сичности в случае полученных диоксолановых аналогов нуклеозидов может быть обусловлено двумя причинами: аналоги нуклеозидов не превращаются в клетке в соответствующие 5'-три-фосфаты или последние не являются ингибиторами ДНК-полимераз. Для выяснения возможной
причины отсутствия противовирусной активности нами был осуществлен синтез аналогов ddTTP (V) и (XV), а также был получен 4'-трифосфат транс-изомера (VI) - аналог а-нуклеозид-5'-три-фосфата.
Получение трифосфатов (V) и (VI) было описано ранее [4]. Обработка нуклеозида (ХП) избытком Р-цианэтилфосфата [10] в присутствии ^Ы'-дициклогексилкарбодиимида приводила после щелочного удаления защитной группы к монофосфату (XIV). Трифосфат (XV) синтезировали с хорошим выходом по методу [11]. 'Н-ЯМР-спек-тры моно- и трифосфата (XIV) и (XV) аналогичны спектрам исходных нуклеозидов.
Субстратные свойства аналогов ddTTP (V), (VI) и (XV) изучались в реакциях синтеза ДНК, катализируемых фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I, концевой дезоксинуклеотидилтрансфера-зой, обратной транскриптазой ВИЧ. Эксперимент проводили следующим образом: к ДНК М13шр10 с [5'-32Р]праймером (последовательность нуклео-тидов синтезируемой цепи ДНК представлена на схеме 2, праймер подчеркнут, порядковые номера нуклеотидов приведены начиная с 5'-концевого нуклеотида) добавляли либо исследуемые соединения (V), (VI), (XV) (рис. 1а, 16, дорожки И -15, 16 - 20,21 - 25 соответственно), либо dTTP (рис. 1а, 16, дорожки 3 - 6), либо ddTTP(3'F) [12,13] (рис. 1а, 16, дорожки 7 - 10). Катализ реакции проводили обратной транскриптазой ВИЧ (рис. 1а) и фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I (рис. 16). Как видно из рис. 1а, 16, соединение (V) является терминирующим субстратом в реакции синтеза ДНК, катализируемой обратной транскриптазой ВИЧ, но не является субстратом в реакции синтеза ДНК, катализируемой фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I. Соединение (XV) включается в цепь ДНК и терминирует синтез ДНК при катализе этой реакции как обратной транскриптазой ВИЧ, так и фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I.
Первичная структура синтезированного фрагмента ДНК М13шр10
10 20 30 40 50
5' СССАС|ТСАСС|АССТТСТААААСОАСООССАСТСССААОСТТООССТССАО
60
70
80
90
100
СТССАСТСТАОАООАТССССООССОАОСТССААТТСОТААТСАТССТСАТ
110
120
130
I
140
АССТОТТТССТСТСТС.АААТТСТТАТСТОСТСАСААТТССАСАСА
Схема 2.
Аналог (VI) не является субстратом ни для обратной транскриптазы ВИЧ, ни для фрагмента Кле-нова ДНК-полимеразы I. Интересно, что в отличие от (1ТТР или ¿{ПТР(З'Р) (рис. 16, дорожки 3 - 6, 7 -10) соединения (V), (VI), (XV) (рис. 16, дорожки 11 - 15, 16 - 20, 21 - 25) практически не инги-блруют 3'—»-5'-экзонуклеазную активность фрагмента Клепова ДНК-полимеразы I. На рис. 1а на
контрольных дорожках 3-4 в присутствии только одного субстрата сЛТР наблюдается удлинение праймера на три нуклеотидных остатка, первым и третьим из которых является с!ТМР. Это объясняется меньшей точностью обратных транскриптаз по сравнению с другими ДНК-по-лимеразами, что отмечалось ранее в ряде публикаций [14, 15].
(а)
10 11 12 13 14 15 16 17 1& 19 20 21 22 23 24 25
Рис, I, Авторадиограмма продуктов элонгации [5'-32Р]олигонуклеотидного праймера обратной транскриптазой ВИЧ (а), фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I (б) и концевой дезоксинуклеотидилтрансферазой (в) в присутствии соединений (V), (VI), (XV). а, б: 1 - комплекс (+)-цепи ДНК М13шр10 с [5'-32Р]праймером; 2 - инкубация комплекса, показанного на дорожке 1, с соответствующим ферментом; дорожки 3 -25 - синтез ДНК в присутствии 25 (3,5), 200 мкМ (4,6) (1ТТР; 25 (7,9) и 200 мкМ (8,10) сШТР(З'Р); 25 (//), 200 мкМ (12,14), I мМ (13,15) соединения (V); 25 (16), 200 мкМ (17, 19), 1 мМ (18, 20) соединения (VI); 25 (21), 200 мкМ (22, 24), 1 мМ (23, 25) соединения (XV). Реакции проводили 20 мии при 31 С в случае обратной транскриптазы ВИЧ и при 22°С в случае фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I, дополнительное удлинение фрагментов ДНК (дорожки 5, 6, 9, 10, 14, 15, 19, 20, 24, 25) проводили в присутствии 400 мкМ четырех сЮТР в течение 20 мин при тех же температурах; реакции останавливали 50 мМ ЕЭТА.
Рис. 16.
Так как в эксперименте с обратной транскрип-тазой ВИЧ большая доля праймера не участвовала в реакции элонгации, о чем свидетельствует наличие радиоактивного 14-членного олигонук-леотида на всех, дорожках (рис. 1а), была проведена дополнительная проверка способности соединений (V), (XV) терминировать синтез ДНК. Для этого исходный [5'-32Р]праймер (рис. 1а, дорожка 1), [5'-32Р]праймеры, удлиненные на один нуклеотид и содержащие на З'-конце либо остаток с!ТМР (до-
рожки 3, 4), либо асГГМР(З'Р) (дорожки 7, 8) и праймеры с присоединенными аналогами (V) (дорожки 12,13) и (XV) (дорожки 22,23), вырезали из геля, элюировали, очищали на колонках со смолой ОЕ-52, сефадексом С-15 и после отжига с матрицей вновь использовали в реакциях синтеза ДНК, катализируемых фр
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.