научная статья по теме СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩИЕ БАКТЕРИИ В ПЛАСТОВЫХ ВОДАХ СИСТЕМЫ ПОДДЕРЖАНИЯ ПЛАСТОВОГО ДАВЛЕНИЯ УСТЬ-ТЕГУССКОГО НЕФТЯНОГО МЕСТОРОЖДЕНИЯ Биология

Текст научной статьи на тему «СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩИЕ БАКТЕРИИ В ПЛАСТОВЫХ ВОДАХ СИСТЕМЫ ПОДДЕРЖАНИЯ ПЛАСТОВОГО ДАВЛЕНИЯ УСТЬ-ТЕГУССКОГО НЕФТЯНОГО МЕСТОРОЖДЕНИЯ»

БИОЛОГИЯ ВНУТРЕННИХ ВОД, 2015, № 1, с. 13-18

^ ВОДНАЯ

МИКРОБИОЛОГИЯ

УДК 579.26;579.68

СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩИЕ БАКТЕРИИ В ПЛАСТОВЫХ ВОДАХ СИСТЕМЫ ПОДДЕРЖАНИЯ ПЛАСТОВОГО ДАВЛЕНИЯ УСТЬ-ТЕГУССКОГО НЕФТЯНОГО МЕСТОРОЖДЕНИЯ © 2015 г. Т. В. Дрогалева*, Я. В. Рыжманова**, М. Б. Вайнштейн**, ***

*Тюменский проектный и научно-исследовательский институт нефтяной и газовой промышленности им. В.И. Муравленко, 625000 г. Тюмень, ул. Республики, 62, e-mail: tdrogaleva@yandex.ru **Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, 142290 г. Пущино, Московская обл., проспект Науки, 5 ***Пущинский государственный естественно-научный институт, 142290 г. Пущино, Московская обл., проспект Науки, 3 Поступила в редакцию 07.11.2013 г.

Из пластовых вод Усть-Тегусского нефтяного месторождения выделены культуры сульфатредукто-ров и определен их таксономический статус. Пластовые воды, используемые для поддержания внут-рипластового давления на месторождении, характеризуются умеренной минерализацией (23.2 г/л) и содержат сульфат (8.4 мг/л). Из них получена накопительная культура сульфатредуцирующих бактерий, которая по результатам TGGE состояла из трех штаммов. Фрагменты генов 16$рРНК у штаммов Y1 и Y2 были генетически близки видам Desulfovibrio alaskensis и D. pshychrotolerans со сходством 99.0 и 95.0% соответственно. Штамм Y2 выделен в чистую культуру и частично охарактеризован. Филогенетический анализ почти полной последовательности гена 16S рРНК показал, что Y2 наиболее близок из известных видов к D. pshychrotolerans: сходство с типовым штаммом, выделенным из соленого озера, составило только 96.5%, что делает его кандидатом для описания нового вида. Показано, что выделенные сульфатредуцирующие бактерии — обитатели пластовых вод, поступающих с добываемой нефтью.

Ключевые слова: сульфатредуцирующие бактерии, пластовые воды, нефтяные месторождения, Desulfovibrio.

Б01: 10.7868/80320965215010052

ВВЕДЕНИЕ

На многих нефтяных месторождениях Западной Сибири для поддержания пластового давления (ППД) применяется вторичное заводнение собственными пластовыми или поверхностными водами. Существуют предположения, что при закачке поверхностных вод в пласт происходит его заражение занесенными извне сульфатредуциру-ющими бактериями (СРБ), развитие которых ведет к коррозии оборудования [13]. Однако в пластовых водах нефтяных месторождений, как и в поверхностных водоемах, существуют микробные сообщества, в том числе бактерии, участвующие в восстановлении соединений серы [4, 6, 12, 18].

При техногенной нагрузке в микробном сообществе пластовых вод происходит изменение соотношения физиологических групп бактерий и могут доминировать коррозионно-агрессивные микроорганизмы [1, 19], что приводит к интенси-

фикации коррозии нефтепромыслового оборудования.

Роль микроорганизмов в коррозии металлов нефтепромысловой отрасли очень велика. В Северной Америке 25—50% опасных случаев коррозии внутренней поверхности трубопроводов обусловлены деятельностью микроорганизмов [25]. В 77% случаев коррозия оборудования нефтяных скважин была вызвана жизнедеятельностью микроорганизмов, среди которых ведущую роль играют СРБ [2]. Опасность этих бактерий для стальных трубопроводов и центрального пункта сбора (ЦПС) нефти основана на том, что они восстанавливают сульфаты и другие соединения серы пластовых вод с образованием сероводорода — коррозионно-опасного газа [15, 24].

Цель работы — определение численности, изучение таксономического состава и физиолого-биохи-мических свойств коррозионно-опасных сульфат-

редукторов в пластовых водах Усть-Тегусского нефтяного месторождения (Тюменская обл.).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования были пробы пластовой воды, отобранные на ЦПС Усть-Тегусского месторождения (Тюменская область, Уватский район). Центральный пункт сбора представляет собой технологическую площадку, на которой расположены объекты и оборудование для подготовки нефти и отделения ее от воды. Пробы отбирали в октябре 2011 г. непосредственно на ЦПС в стерильные стеклянные емкости, герметично закрывали и в течение суток доставляли в лабораторию для дальнейших анализов.

Химический анализ вод проводили согласно соответствующим методикам (ПНД Ф 14.1:2.98-97; ПНД Ф 14.2.99-97; ПНД Ф 14.1:2.95-97; ПНД Ф 14.1:2.50-96; ПНД Ф 14.1:2.111-97; РД 52.24.405-95). Общее содержание ионов № и К определяли расчетным путем. Суммарную минерализацию вод определяли путем сложения концентраций хлоридов, гидрокарбонатов, сульфатов, Са, М§, Ш, К и Fe [11].

Выбор сред и условий культивирования СРБ определяли физико-химической характеристикой исследуемой воды. Для получения накопительных культур СРБ применяли модифицированную среду Постгейта с добавками следующего состава, г/л: КН2Р04 - 1.0, N^0 - 1.0, М§804 • 7Н20 - 2.0, Са804 — 1.0, лактат натрия (50%-ный раствор) — 4.0, №С1 — 5.0. Добавки вносили в указанном порядке из стерильных растворов в питательную среду непосредственно перед посевом: 5%-ный раствор дрожжевого экстракта (1 г/л); 5%-ный раствор FeSO4 • 7Н20 в 2%-ном растворе соляной кислоты (0.5 г/л); 5%-ный раствор №НС03 — по каплям до установления рН среды 7.2; 5%-ный раствор • 9Н20 вносили в 5%-ном растворе гидрокарбоната натрия до появления у среды серого оттенка [10].

Накопительные культуры СРБ выращивали в пенициллиновых флаконах, анаэробно заполненных готовой средой. Для посева пробу пластовой воды, отобранной на ЦПС, как инокулят, вносили стерильным шприцем во флакон со средой. Засеянные флаконы инкубировали при температуре 33—35°С в течение 15 сут, отмечая появление роста СРБ по образованию сероводорода -появлению и увеличению количества осадка сульфида железа.

Численность СРБ в нефтепромысловых водах определяли путем посева проб на среду, состав которой описан выше, методом предельных разведений. Для каждой пробы воды выполняли десять разведений, каждое разведение - в трех по-вторностях. Индекс активности полученной на-

копительной культуры вычисляли по формуле I= = 100/а, где a — сутки, на которые обнаружен рост СРБ [10].

Чистую культуру СРБ поддерживали на среде SR следующего состава, г/л: KH2PO4 — 0.5, NH4Cl — 1.0, Na2SO4 - 2.0, CaCl2 • 2H2O - 0.1, MgSO4 • 7H2O -2.0, DL-Na-лактат — 2.0, дрожжевой экстракт — 1.0, резазурин — 0.001, раствор витаминов по Волину — 10 мл, раствор микроэлементов SL-10—1мл. рН среды доводили 5%-ным раствором NaHCO3 до 8. Посевы инкубировали при температуре 28— 29°C в пробирках Хангейта с рабочим объемом среды 10 мл.

Физиолого-биохимические особенности выделенного штамма Y2 изучали с применением общепринятых методов [8]. Морфологию культур исследовали в препаратах типа "раздавленная капля" с иммерсией в фазовом контрасте при увеличении х1000 под световым микроскопом Carl Zeiss — Axiostar plus (Германия).

Концентрацию сероводорода в пробах и культурах определяли йодометрическим титрованием [10] или по методу Пахмайера [15].

ДНК из накопительной и чистой культуры СРБ экстрагировали с помощью Genomic DNA Purification Kit ("Fermentas", Литва). Концентрацию и чистоту выделенной ДНК измеряли на NanoPho-tometer®P-Class ("Implen", Германия). Для амплификации фрагмента гена 16S рРНК использовали пары универсальных праймеров с клампом: BAC338F/PRUN518R-GC (ACTCTTACGGGAG-GCAG/CGCCCGCC-GCGCCCCGCGCCCGT CCCGCCGCCCCGCCCC-ATTACCGCGGCT -GCTGG); 1055f/pH1541-1522R-GC (ATGGCT-GTCGTCA GCT/CGCCCGCCGCGCGCG-GCGGGC- GGGGCGGGGGCACGGGGGGGC-AAGGAGGTGATCCAGCC GCA).

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили на амплификаторе Терцик ДНК-Технология (Россия). Для получения ПЦР-фрагментов применяли следующий температурно-временной режим: начальная денатурация — 94°C х 3 мин; последующие 30 циклов — 94°C х 30 с, 55°C х 10 с, 72°C х 30 с; конечная полимеризация — 72°C х х 1 мин. Реакционная смесь (25 мкл) содержала: 1 х буфер для Taq-полимеразы ("Fermentas", Литва), 10 нг ДНК-матрицы, по 50 мкмоль каждого dNTP ("Fermentas", Литва), по 10 пмоль соответствующих праймеров ("Синтол", Россия), 2.5 ммоль MgCl2 и 1 ед. Taq-полимеразы ("Си-лекс", Россия). Полученные фрагменты для проверки размера ампликонов, их количества и наличия загрязнений анализировали в 1%-ном ага-розном геле, содержащем бромид этидия.

ПЦР-фрагменты с использованием температурного градиентного гель-электрофореза (ТГГЭ) анализировали с помощью прибора TGGE System

СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩИЕ БАКТЕРИИ В ПЛАСТОВЫХ ВОДАХ

15

("Biometra", Германия) в денатурирующем геле (1 х ТАЕ-буфер, 6%-ный полиакриламидный гель, мочевина 8М, глицерин 2%, формамид 20%). Температурный градиент (33—44°C) был оптимизирован для эффективного разделения полос. Гель окрашивали бромидом этидия (0.5 мкг/мл в 1 х ТАЕ-буфере). Отдельные полосы вырезаны и непосредственно использованы для переамплификации. Выделение и очистку из ага-розного геля полученных ПЦР-фрагментов осуществляли с использованием набора реактивов "Выделение ДНК из агарозных гелей на магнитных частицах, покрытых SiO2" ("Силекс", Россия) согласно рекомендациям производителя.

Секвенирование ДНК проводили в Межинститутском центре коллективного пользования Геном ИМБ РАН с помощью набора реактивов "ABI PRISM® BigDye™" Terminator v. 3.1 ("Applied Biosystems", США) с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3730 ("Applied Biosystems", США). Для поиска в GenBank нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК использовали программу BLAST базы данных NCBI (http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Редактировали и выравнивали последовательности с помощью пакета программ ClustalX [28]. Филогенетическое древо построено на основании нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК исследуемых штаммов и родственных видов рода Desulfovibrio с помощью алгоритма "ближайших соседей" ("neighbour-joining") [22], реализованного в пакете программ MEGA 5 [27].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При оценке численности СРБ на среде Постгейта с лактатом в качестве источника углерода и энергии уже в первые сутки после посева обнаружены признаки роста сульфатредукторов — помутнение среды и появление черного осадка. Таким образом, индекс ак

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком