БИОЛОГИЯ ВНУТРЕННИХ ВОД, 2013, № 1, с. 18-23
ВОДНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 579.68+579.266.4
СУЛЬФАТВОССТАНАВЛИВАЮЩАЯ БАКТЕРИЯ Desulfobulbus sp. ШТАММ BH ИЗ ПРЕСНОВОДНОГО ОЗЕРА В ПРОВИНЦИИ ГУЙЧЖОУ, КИТАЙ
© 2013 г. К. С. Фишман*, В. Н. Акимов*, Н. Е. Сузина*, М. Б. Вайнштейн*, **, К. Лианг (X. Liang)***
*Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, 142290 г. Пущино, Московская обл., проспект Науки, 5, e-mail: fishmanks@rambler.ru **Пущинский государственный университет, 142290 г. Пущино, Московская обл., проспект Науки, 3 ***Institute of Geochemistry, Chinese Academy of Sciences, 46Guanshui Road, Guiyang, Guizhou 550002, P.R. China Поступила в редакцию 13.09.2011 г.
Проведены исследования сульфатвосстанавливающих бактерий (СВБ) из анаэробных донных осадков пресного оз. Байхуа (провинция Гуйчжоу, Китай) на эвтрофированных участках, подверженных загрязнению тяжелыми металлами, в частности ртутью. Доминирующие СВБ представлены бактериями рода Desulfobulbus. Подробное исследование доминирующего изолята Desulfobulbus 8р., обозначенного как штамм ВН, показало, что он отличается по генетическим, морфологическим и фи-зиолого-биохимическим признакам от других видов рода. Эти бактерии используют широкий спектр органических субстратов и проявляют высокую активность сероводородообразования, что позволяет их считать важным компонентом микробного сообщества в загрязняемом металлами и эвтрофицируемом водоеме.
Ключевые слова: сульфатвосстанавливающие бактерии, Desulfobulbus, распространение, разнообразие, пресноводное озеро.
DOI: 10.7868/S032096521301004X
ВВЕДЕНИЕ
Сульфатвосстанавливающие бактерии (СВБ) участвуют на конечных этапах анаэробной деструкции органического вещества (ОВ). СВБ осуществляют разрушение ОВ в придонных слоях воды и донных осадках водоемов. Ежегодно в водные экосистемы попадают тысячи техногенных веществ, многие из которых токсичны. СВБ могут разрушать многие загрязняющие органические соединения, а также связывать в нерастворимые сульфиды ионы тяжелых металлов, находящиеся в растворе. Из токсичных металлов в водоемах есть ртуть, свинец, кадмий, олово, цинк, марганец и никель; известна токсичность и других металлов, например кобальта, серебра, золота и урана.
Разнообразие СВБ велико, но не все группы и роды исследованы подробно. Мало изучен род Desulfobulbus. Он включает пять видов: D. propioni-cus Widdel, 1981, D. elongatus Samain et al., 1985, D. rhabdoformis Lien et al., 1998, D. mediterraneus Sass
et al., 2002, D. japonicus Suzuki et al., 2007. Представители этого рода способны окислять субстрат с образованием ацетата как конечного продукта окисления [10]. Большинство штаммов рода обнаружены в анаэробных донных отложениях водоемов, прежде всего соленых морских: например, штаммы вида D. propionicus выделены из Северного моря, канавы и пруда [13], D. mediterraneus — из Средиземного моря [11], D. japonicus — из Японского моря [12]. Таким образом, бактерий этого рода можно считать постоянными компонентами бентосных микробных сообществ. В работе описан новый представитель рода Desulfobulbus, выделенный из донных осадков загрязняемого ртутью оз. Байхуа (Baihua) в провинции Гуйчжоу, Китай.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Образцы донных осадков для микробиологического изучения взяты из пресноводного оз. Байхуа, одного из пяти основных источников питьевой воды г. Гуйян на юго-западе китайской
СУЛЬФАТВОССТАНАВЛИВАЮЩАЯ БАКТЕРИЯ Desulfobulbus sp.
19
Таблица 1. Уровни сходства гена 168 рРНК штамма Desulfobulbus 8р. ВН с генами 168 рРНК типовых штаммов рода Desulfobulbus
Типовые штаммы видов рода Desulfobulbus Сходство с Desulfobulbus sp. ВН, %
D. propionicus ATCC 33891T (AY548789) 95.6
D. elongatus ATCC 43118T (X95180) 95.2
D. rhabdoformis ATCC 700652T (U12253) 93.1
D. mediterraneus DSM 13871T (AF354663) 92.3
D. japonicus JCM 14043T (AB110549) 91.2
Примечание. В скобках указаны номера нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК в Генбанке.
провинции Гуйчжоу. Озеро создано в 1960 г., его площадь 13.5 км2. В период отбора проб средняя температура воды была 22.3°С, рН 7.4.
При выделении культур микроорганизмов использовали анаэробную технику культивирования [8]. Для продувания сосудов культивирования применяли
Базовая среда фВ) для выделения чистой культуры СВБ имела следующий состав, г/л: Ш2804 • 10 Н20 - 3.0, КН2Р04 - 0.2, N^0 - 0.3, М§804 • 7 Н20 - 0.4, ШС1 - 1.0, КС1 - 0.5, пропи-онат № - 1.5. Отдельно стерилизовали и добавляли восстановитель №28 • 9 Н20 (10%-ный раствор в 1%-ном растворе №НС03) - 1.0 мл/л. Среды стерилизовали автоклавированием при избыточном давлении 0.5 атм. 30 мин. Растворы органических субстратов, тестируемых вместо пропио-ната, и другие добавки стерилизовали отдельно и вносили в среду непосредственно перед посевом. Все используемые реагенты имели аналитическую степень чистоты ("чда"), рН среды 7.2-7.4. Культивировали в пробирках Хангейта объемом 22 мл или во флаконах с резиновыми пробками объемом 150 мл.
Первичным инокулятом служили образцы осадков, вносимые при посеве в количестве 10% засеваемого объема. Накопительные культуры СВБ получали на среде указанного выше состава с модификациями по органическим субстратам. Флаконы инкубировали при температуре 30°С в течение 14 сут. Затем пробы анализировали микроскопически и для дальнейшей работы отбирали накопительные культуры с доминированием СВБ. В результате исследована культура ВН8, выделенная из наиболее глубокой и загрязненной тяжелыми металлами пробы донных отложений.
Концентрацию образуемого в среде сероводорода определяли колориметрически по методу Пахмайера [9]. В основе анализа лежит перевод сероводорода в сульфид цинка с последующей реакцией с диамином и железоаммонийными квасцами. Измерения проводили на спектрофотометре 8ресо1-221 (Германия) при 660 нм; для получения калибровочной кривой использовали раствор №28 известной концентрации.
Секвенирование для идентификации изолята проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) [4] с использованием универсального праймера 27f в смеси (10 мкл), состоящей из очищенного ПЦР-продукта — 1.6 мкл, H2O — 1.6 мкл, праймера — 0.8 мкл и 6 мкл стандартного набора CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing kit (Beckman Coulter, США), включающего в себя дидезокси-рибонуклеозидтрифосфаты, меченые флуоресцентной меткой. Нуклеотидную последовательность определяли на автоматическом ДНК-се-квенаторе CEQ2000 XL (Beckman Coulter, США).
Для сравнительного изучения изолята использовали типовые штаммы и культуры видов рода Desulfobulbus из Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ), любезно предоставленные Шпрингом: Desulfobulbus sp. DSM 2033, 10215, 10218, D. propionicus DSM 2032, 2554, D. elongatus DSM 2908.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Начиная с 1994 г. в оз. Байхуа наблюдается ухудшение состояния воды [3]: разложение органических веществ в верхних слоях донных осадков с участием СВБ приводит к сезонной аноксии с выходом из грунтов в водную толщу свинца, марганца и сероводорода, увеличению концентрации нитритов, почернению воды (вероятно, за счет образования тонкой взвеси сульфидов металлов) и гибели рыбы. В 2004 г. Хоу с соавт. [6] сообщили о загрязнении озера ртутью, при этом накопление ртути увеличивалось в зонах выраженной эвтрофикации. Жоу с соавт. [14] указали на компании Guizhou Crystal Group и Guiyang Gas Works как на основной источник загрязнения металлами, Хуанг с соавт. [7] подтвердили продолжающийся процесс аккумуляции тяжелых металлов (Pb, Cd, As, Cu и Zn) в водоеме. Активность СВБ, связанная с образованием сероводорода, в данном случае может играть не только отрицательную роль (формирование аноксии), но и важную положительную роль, так как токсичные тяжелые металлы связываются в нерастворимые и захороняемые в осадках сульфиды. Концентрация ртути в водах озера составляет в среднем
мг/л 100
80
60
10
20 г/л
Рис. 1. Морфология клеток трех штаммов Desulfobul-bus при анаэробном культивировании в жидкой среде: а — D. sp. ВН, б — пресноводный штамм D. sp. DSM 10215, в — типовой штамм D.propionicus DSM 2032.
33.2 нг/л, что превышает содержание ртути в других озерах этой местности почти в 1.5 раза [5].
При засеве донными осадками среды DB с пропионатом уже через 7 сут отмечено интенсивное почернение осадка и образование сероводорода. Из разных слоев донных отложений получены пять накопительных культур: ВН1, ВН2, ВН4, ВН5, ВН8. При их микроскопии обнаружены бактерии различных морфотипов, в том числе ха-
Рис. 2. Образование сероводорода штаммом Desulfob-ulbus sp. BH при различных концентрациях NaCl.
рактерный для представителей рода Desulfobulbus. Наибольшую активность роста и образования сероводорода показала культура ВН8, выделенная из наиболее глубокого слоя образца донных осадков (35 см). Анализ общей ДНК, выделенной из накопительной культуры ВН8, с помощью ПЦР с группоспецифичными для СВБ праймерами [7] показал преимущественное наличие представителей рода Desulfobulbus. ПЦР-продукт, полученный при амплификации с праймерами DBB121 и DBB1237, специфичными для рода Desulfobulbus, использовали для проведения сиквенса. По данным анализа секвенированного фрагмента гена 168 рРНК (~500 нуклеотидов) изолят наиболее близок видам D. ртрютеш и D. elongatus и имеет уровень сходства с ними по данному гену <96% (табл. 1), что позволяет считать данный штамм ВН кандидатом для нового вида рода Desulfobulbus.
Чистая культура Desulfobulbus 8р. BH получена пересевами единичных колоний в твердой (ага-ризованной) среде. Электронная микроскопия бактерий в твердой и жидкой средах показала, что несмотря на общую тенденцию к образованию "бульбусов" — толстых палочек с заостренными концами, культура ВН морфологически вариабельна и может образовывать необычно мелкие клеточные формы размером в ~300 нм (рис. 1). Образование таких форм описано для ряда аэробных бактерий [1, 2], но для анаэробных бактерий, в частности для СВБ, оно показано впервые.
Подавляющее большинство известных штаммов рода Desulfobulbus выделено из морских и солоновато-водных водоемов. С
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.