МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 84, № 5, с. 570-581
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
СУЛЬФАТВОССТАНАВЛИВАЮЩАЯ БАКТЕРИЯ DESULFOVIBRIO HONTREENSIS SP. NOV., ВЫДЕЛЕННАЯ ИЗ МОРСКИХ ОБРАСТАНИЙ В РАЙОНЕ ПРИБРЕЖНОЙ ЗОНЫ ЮЖНОГО ВЬЕТНАМА
© 2015 г. А. Л. Тарасов*, 1, Г. А. Осипов**, И. А. Борзенков*
*Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва **Научный центр сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева РАН Поступила в редакцию 22.04.2015 г.
Из морских обрастаний прибрежной зоны Южно-Китайского моря (г. Нячанг, СРВ) выделен штамм МЕ рода Desulfovibrio, имеющий физиологическое и филогенетическое сходство с видами "D. caledoniensis" SEBR 7250, D. portus MSL79 и D. dechloracetivorans ATCC 700912 (степень сродства генов 16S рРНК составляет 96.9, 95.9 и 95.8% соответственно). Грамотрицательные подвижные клетки штамма МЕ имеют форму вибрионов (0.4—0.6 х 1.3—2 мкм) с одним жгутиком. Штамм МЕ растет при температуре от 20 до 39°С (оптимум роста при 34—37°С), в диапазоне рН от 5.8 до 8.5 (оптимум рН 6.8—7.5) и при солености 0.08—1.1 M Na+ (оптимум 0.2—0.3 М Na+). В присутствии сульфата штамм МЕ растет авто-трофно на водороде, а также на лактате, формиате, пирувате, фумарате, малате, слабо — на сукцинате, глицерине, фруктозе. В отсутствие сульфата штамм МЕ сбраживает пируват, слабо — малат, но не лактат. В качестве акцепторов электронов использует сульфат, сульфит, тиосульфат; элементную серу и димети-сульфоксид. Витамины и дрожжевой экстракт не обязательны для роста. Содержание Г + Ц — 52.4 мол. %. В составе клеточных жирных кислот преобладали C18:0 (13.9%), C16:0 (9.6%), iso-C16:0 (9.5%), C18:1w7 (8.8%), anteiso-C15:0 (8.1%), а также iso-C17:1 (7.2%). Состав жирных кислот штамма МЕ близок к составу штамма D. dechloracetivorans ВО и имеет сходство с D. portus. На основании генотипических и фенотипических признаков штамм МЕ может рассматриваться как в новый вид с названием Desulfovibrio hontreеnsis sp. nov.
Ключевые слова: сульфатвосстанавливающие бактерии, Desulfovibrio, морские обрастания, коррозия, Desulfovibrio hontreensis sp. nov.
DOI: 10.7868/S0026365615050171
Исследование образцов из морских обрастаний в южной части Вьетнама, отобранных с поверхности металла, показало присутствие разнообразной сульфатредуцирующей микрофлоры в различных типах обрастаний, не только под раковинами ракообразных и моллюсков, но и в более тонких поверхностных биопленках (Tarasov, Borzenkov, 2015). Выделенные штаммы сульфат-восстанавливающих бактерий (СВБ) были близки к видам D. salexigens (штаммы PE и OZB), D. marinisediminis (штаммы Mol4 и Mol5), D. alaskensis (штамм DB3), D. bizertensis (штамм RH2), D. indonesiensis (штамм OP12) и D. dechloracetivorans (штамм BO), степень сходства генов 16S рРНК превышала 99%. Кроме того, был выделен штамм Desulfovibrio sp. МЕ, степень родства которого с наиболее близкими видами D. dechlorace-tivorans ATCC 700912, "D. caledoniensis" SEBR 7250
1 Автор для корреспонденции (e-mail: tarasov1357432@yandex.ru).
и D. portus MSL79 не превышала 97%. Группа СВБ, близких к виду D. dechloracetivorans привлекает внимание в аспектах, имеющих не только теоретическое, но и практическое значение. Штаммы " D. caledoniensis" исследованы как активные агенты коррозии металла (Cetin, Aksu, 2011; Mori et al., 2010), а также как деструкторы хлорированных бифенилов (Wu et al., 2002). D. dechloracetivorans был описан как деструктор хлорированных фенолов (Sun et al., 2000), для некоторых изолятов показана способность метилировать ртуть (Gilmour et al., 2011). Вместе с тем эта группа, в которую входят выделенные нами штаммы ВО и МЕ, изучена неполно с точки зрения физиологии и филогении.
Целью настоящей работы было изучение филогенетического положения и физиолого-биохи-мических особенностей штамма МЕ для определения его систематического положения среди видов Desulfovibrio.
MATEPИAЛЫ И МЕТОДЫ ИCCЛEДOBAHИЯ
Объект исследования. Штаммы были выделены из морских обрастаний образцов металла, размещенных на стендах морской научно-исследовательской и испытательной станции совместного Pоссийско-Bьетнамского Тропического Центра. Cтенды располагались в заливе острова Хон-Тре (Hon Tre) вблизи г. Hячанг (Nha Trang) в Южно-Kитайском море. Пробы получали путем соскабливания нижнего, как правило, черного, прилегающего к металлу, слоя обрастания. Полученный материал отбирали в стерильные пробирки объемом 15 мл, доливали стерильной морской водой и закрывали резиновыми пробками без пузырьков воздуха. Штамм BO выделен из черного осадка с внутренней части гайки, на месте разрушенного коррозией болта. Штамм ME выделен с поверхности пластины нержавеющей стали под основанием раковин двустворчатых моллюсков Saccos-trea cucullata, размером 1—2 см, выросших на этой пластине.
Методы культивирования. В качестве основы для получения накопительных культур и выделения анаэробных микроорганизмов использовали среду, содержащую в г/л: NaCl — 20.0; KCl — 0.6; NH4Cl - 0.3; K2HPO4 - 0.05; MgCl2 • 6H2O - 5.0; Na2SO4 — 3.0 или в некоторых случаях Na2S2O3 — 2.0; CaCl2 • 2H2O - 0.15; MES - 0.5; MOPS - 0.5; Tris - 0.6; дрожжевой экстракт ("Difco") - 0.25; раствор резазурина (0.2%) - 1 мл; раствор микроэлементов и раствор витаминов вносили согласно описанной ранее методике (Widdel, Back, 1992), также дополнительно к микроэлементам вносили 1 мл 0.01 мM раствора Na2SeO3 и Na2WO4. После стерилизации вносили раствор цистеина и сульфида до конечной концентрации 0.2-2.0 мМ, а также раствор №HCO3 до конечной концентрации 10-25 мМ и значения рH 7.0 в среде. Kульту-ры инкубировали при температуре 350C.
Hакопительные культуры были получены в среде с газовой фазой H2/CO2 (80 : 20) при избыточном давлении 0.5 атм (52 K^), с добавлением ацетата (5 мМ) и Na2S2O3 (8 мМ). В качестве дополнительного восстановителя и индикатора роста CBБ добавляли FeSO4 (2 мМ). В дальнейших пассажах была использована среда с лактатом (20 мМ) без FeSO4, дрожжевого экстракта и витаминов. Hакопительную культуру пересевали 4-5 раз, добиваясь преимущественного роста определенных морфотипов микроорганизмов.
Чистые культуры CBБ выделяли из колоний, полученных методом пересева из предельных разведений на агаризованную среду указанного выше состава (roll tube method) в атмосфере CO2/H2 с добавлением ацетата и Na2S2O3. Чистоту изолята контролировали посевами на среды с органическими субстратами в аэробных и анаэробных
условиях, микроскопиеи и анализом последовательности гена 16S рРНК.
Физиолого-биохимические исследования. Изучение зависимости скорости роста от температуры, рН и солености проводили на среде с лакта-том. Необходимое значение рН устанавливали путем внесения 0.5 М растворов HCl или Ма2СО3. Скорость роста культур определяли по оптической плотности (OD600) и образованию H2S, концентрацию которого измеряли с помощью тест-набора фирмы ("Merck", Германия) в фотометрическом варианте. Субстратную специфичность определяли на указанной выше среде при концентрации исследуемого субстрата 10—15 мМ. Во всех экспериментах каждый вариант ставили в 2—3 повтор-ностях. Отсутствие изменений оптической плотности культуры и концентрации H2S в течение 21 сут интерпретировали как отсутствие роста.
Для определения жирнокислотного состава использовали биомассу в конце экспоненциальной фазы роста, полученную на среде с лактатом и сульфатом при 34°С. Экстракцию жирных кислот проводили в условиях кислого метанолиза из 5 мг лиофильно высушенной биомассы в 0.4 мл метанола с 1.2 M HCl при 80°С в течение 1 ч. Метилированные эфиры жирных кислот дважды экстрагировали 0.2 мл гексана и анализировали с помощью хромато-масс-спектрометра на приборе AT-5850/5973 фирмы "Agillent Technologies" (США).
Присутствие десульфовиридина определяли спектрофотометрически по абсорбции клеточных экстрактов при 630 нм (Badziong et al., 1978). Каталазную активность оценивали качественно следующим образом: 50 мкл 3% Н2О2 наносили на поверхность биомассы, отобранной в конце логарифмической фазы роста культуры и осажденной из 1 мл клеточной суспензии центрифугированием (5 мин при 5000 g).
Морфологию клеток изучали в условиях фазового контраста на оптическом микроскопе ("Carl Zeiss", Германия) при увеличении х1000.
Электронную микроскопию целых клеток осуществляли путем их негативного окрашивания с помощью 2% фосфорновольфрамовой кислоты. Препараты просматривали в электронном микроскопе EC-100C ("Jeol", Япония).
Содержание Г + Ц в ДНК определяли методом термальной денатурации с использованием спектрофотометра Unicam SP 1800 (Великобритания) при скорости нагрева 0.5°^мин, рассчитывая согласно методу (Owen et al., 1969).
Идентификация изолированных чистых культур. Таксономическую принадлежность исследованных микроорганизмов определяли на основе сравнительного филогенетического анализа последовательностей генов 16S рРНК. Для амплификации и секвенирования фрагментов генов 16S
рРНК, использовали универсальные праймеры: 11F (5'-GTTTGATCMTGGCTCAG-3'); 518R (5'-CGTATTACCGCGGCTGCTGG-3'), 1100R (5'-AGGGTTGCGCTCGTTG-3'), 1492R (5'-TACG-GTTACCTTGTTACGACTT- 3 '), (Turner et al., 1999; Lane, 1991; Kane et al., 1993). Секвенирова-ние проводили в центре "Syntol" (Россия, Москва). Все пробелы и неидентифицированные основания были исключены из анализа.
Первичный анализ нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК осуществляли с помощью базы данных и программного обеспечения NCBI Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast).
Полученные последовательности были выровнены с помощью приложения CLUSTAL W, входящего в программу MEGA 5.2.2. (Tamura et al., 2011). При построении филогенетического дерева использовали метод neighbor-joining, реализованный в пакете программы Mega 5.2.2. Статистическую достоверность ветвления оценивали с помощью метода "bootstrap" анализа 1000 альтернативных деревьев.
Полученные последовательности депонированы в GenBank под номерами KP682305 и KP682306.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Характеристика штамма ВО. По данным анализа гена 16S рРНК выделенный нами штамм ВО был идентифицирован как Desulfovibrio dechlora-cetivorans (99.6% сходства). Сравн
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.