НЕЙРОХИМИЯ, 2015, том 32, № 3, с. 265-270
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 577
СВЕРХМАЛЫЕ ДОЗЫ ТЕТРАГИДРОКАННАБИНОЛА СПОСОБСТВУЮТ ВЫЖИВАНИЮ НОВЫХ КЛЕТОК В ЗУБЧАТОЙ ФАСЦИИ ВЗРОСЛЫХ КРЫС © 2015 г. А. Ю. Иванова-Дятлова, В. А. Аниол*, Н. В. Гуляева
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН
Ранее было показано, что однократный эпизод генерализованных судорог, вызванный введением пентилентетразола, сопровождается нарушениями обучения и памяти у грызунов. Временная динамика возникновения этих нарушений позволяет предположить участие в их развитии изменений постнатального нейрогенеза. С другой стороны, известно протекторное действие агониста канна-биноидных рецепторов тетрагидроканнабинола в отношении когнитивных нарушений, возникающих вследствие перенесенных судорог. Целью работы было выяснить, влияет ли тетрагидроканна-бинол на процесс постнатального нейрогенеза в гиппокампе, и существует ли связь между изменениями интенсивности нейрогенеза под действием тетрагидроканнабинола и показателями памяти у крыс. Было обнаружено, что воздействие тетрагидроканнабинола в сверхмалой дозе (2 мкг/кг) на ранних стадиях дифференцировки способствует выживанию новых клеток в гиппокампе. Обнаружена достоверная корреляция числа выживших через три месяца новых клеток в гиппокампе и показателей кратковременной и долговременной памяти у крыс, что может указывать на участие протекторного действия тетрагидроканнабинола в отношении молодых клеток гиппокампа в реализации его когнитивных эффектов.
Ключевые слова: тетрагидроканнабинол, пентилентетразол, нейрогенез, кратковременная память. БО1: 10.7868/81027813315030048
ВВЕДЕНИЕ
Процесс постнатального нейрогенеза, протекающий в течение всей жизни, обеспечивает постоянное замещение и обновление нейронов в герминативных зонах взрослого мозга: субвен-трикулярной зоне (СВЗ) боковых желудочков и субгранулярной зоне — зубчатой фасции (ЗФ) гиппокампа. Значение постнатального нейроге-неза и роль новых нейронов в функционировании мозга остаются не до конца ясными; в то же время известно, что интенсивность образования новых нейронов во взрослом мозге может меняться под действием различных физиологических и патологических факторов [1]. В частности, было неоднократно показано усиление пролиферации клеток в герминативных зонах взрослого мозга при развитии судорожной активности, причем морфологические и электрофизиологические свойства нейронов, образующихся после судорог, отличаются от нормальных [2, 3]. Возможно, именно изменения нейрогенеза лежат в основе медленно развивающихся нарушений гиппокамп-зависимой памяти, наблюдаемых у грызунов в течение нескольких месяцев после судорог [4, 5].
* Адресат для корреспонденции: 117485, Москва, ул. Бутлерова, 5а, e-mail: aniviktor@yandex.ru.
Было также обнаружено, что введение агониста каннабиноидных рецепторов Д9-тетрагидрокан-набинола (ТНС) в сверхнизкой дозе (2 мкг/кг) способно предотвращать развитие нарушений обучения в эксперименте после однократного судорожного приступа, вызванного аллостериче-ским ингибитором ГАМК-А рецепторов пенти-лентетразолом (ПТЗ) [4]. Такое протекторное действие ТНС может быть связано с его участием в регуляции постнатального нейрогенеза в ЗФ, в частности, способствуя долговременному выживанию новых нейронов после судорог. С целью проверки этого предположения исследовалось влияние ТНС в сверхмалой дозе на выживание новых клеток в герминативных зонах мозга крыс после однократного приступа судорог, а также возможную связь между числом новых клеток в гиппокам-пе и производительностью памяти у крыс.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Схема эксперимента
В эксперименте использовали 50 самцов крыс линии Вистар (питомник "Столбовая" РАМН) в возрасте трех месяцев на начало эксперимента. Животных содержали при 12-часовом цикле день/ночь, со свободным доступом к воде и пище.
ВгШ
День 0 День 1 День 2 Л Л
Эксперимент 1
Эксперимент 2
1 — №С1 + кремофор
2 — ПТЗ + кремофор
3 - ТНС + №С1
4 - ТНС + ПТЗ
5 - ПТЗ + ТНС
V
V
ВгШ
День 90
V
4-8 нед:
исследование памяти 3 мес.:
окрашивание на ВгёИ подсчет ВгёИ+ клеток А
ч /-
День 1 День 2 День 3 День 4 День 90
Рис. 1. Схема эксперимента.
Слева указана последовательность введения препаратов животным различных групп (1-5): ПТЗ (70 мг/кг), ТНС (2 мкг/кг) и/или соответствующих контрольных веществ (0.9% раствора №С1 и растворителя для ТНС - кремофора); инъекции обозначены бесцветными стрелками. Всем животным вводили также маркер репликации ДНК - ВМИ (50 мг/кг) за день до введения ПТЗ и/или ТНС (эксперимент 1) или в течение двух дней после этого (эксперимент 2); инъекции ВМИ обозначены темными стрелками.
Справа указаны исследования, проведенные через 4-8 нед (тесты опознавания нового предмета и социального опознавания) и три месяца (получение и окрашивание срезов мозга, подсчет клеток) после введения ПТЗ и/или ТНС.
Крысы были случайным образом разделены на пять групп (в каждой группе п = 10), получавших ТНС (2 мкг/кг в растворителе "кремофор"), ПТЗ (70 мг/кг в изотоническом растворе МаС1), их комбинацию (группы пре- и посткондиционирования судорог), а также чистый растворитель "кремофор" и изотонический раствор №С1 (контрольная группа). Действующие вещества вводили внутрибрюшинно последовательно в течение двух дней (рис. 1):
контрольная группа - раствор №С1 (день 1) и растворитель "кремофор" (день 2);
группа ПТЗ - ПТЗ (день 1) и растворитель "кремофор" (день 2);
группа ТНС - ТНС (день 1) и раствор №С1 (день 2);
группа ТНС + ПТЗ - ТНС (день 1) и ПТЗ (день 2; прекондиционирование судорог ТНС);
группа ПТЗ + ТНС - ПТЗ (день 1) и ТНС (день 2; посткондиционирование судорог ТНС).
Кроме того, всем животным вводили маркер делящихся клеток 5-бром-2'-дезоксиуридин (ВгёИ, 50 мг/кг, 4 инъекции, суммарная доза 200 мг/кг), причем использовали две схемы введения (эксперименты 1 и 2 на рис. 1):
Эксперимент 1. Пяти животным из каждой группы (группы 1-5 на рис. 1) ВгёИ начинали вводить за 24 ч до первого дня эксперимента (вве-
дения раствора №С1/ТНС/ПТЗ) с промежутками между инъекциями по 2 ч. При данной схеме введение ВгёИ предшествовало экспериментальному воздействию (введению ТНС или судорогам, вызванным ПТЗ). Это позволяло оценить эффект судорог, ТНС или их совместного воздействия на уже поделившиеся клетки, находившиеся на этапе созревания и дифференцировки (клетки-предшественники и нейробласты).
Эксперимент 2. Оставшимся пяти животным каждой групппы делали по две инъекции ВгёИ в течение двух дней после окончания инъекций раствора МаС1/ТНС/ПТЗ с промежутками между уколами по 12 ч. Для мечения ВгёИ выбирался момент времени, когда число делящихся клеток максимально увеличено: 3-й-4-й день после судорог [6]. Применение такой схемы мечения позволило оценить уровень пролиферации и, в дальнейшем, выживания клеток, образовавшихся после ПТЗ-индуцированных судорог и/или воздействия ТНС.
Анализ функций кратковременной и долговременной памяти
В течение 4-й-8-й нед. после начала эксперимента поведение животных оценивали в тестах опознавания нового предмета (через 4 нед) и социального опознавания (через 8 нед). Тесты про-
СВЕРХМАЛЫЕ ДОЗЫ ТЕТРАГИДРОКАННАБИНОЛА
267
водили, как описано в предыдущей работе [5]. Оценивали параметры кратковременной (через 40 мин после обучения) и долговременной (через 24 ч) памяти животных в тесте распознавания нового предмета и параметры кратковременной (через 40 мин) памяти в тесте социального опознавания.
Иммуногистохимическое окрашивание на BrdU и подсчет числа выживших через 3 мес. новых клеток
Через 3 мес. после начала эксперимента крысы были декапитированы, мозг в течение двух часов фиксировали в растворе AFA (этанол : формалин : : ледяная уксусная кислота в соотношении 7 : 3 : 1) методом погружения и до дальнейшего использования хранили в 70%-ном этаноле. Затем готовили фронтальные срезы мозга толщиной 50 мкм при помощи вибратома Leica (VT1200S). Использовали срезы в области латеральных желудочков мозга (+1.2.. .—0.3 мм от брегмы) и переднего гип-покампа (—2.3.—3.8 мм от брегмы), по 3—4 среза структуры для каждого животного, расстояние между срезами 600 мкм. Срезы окрашивали на BrdU при помощи непрямого иммунопероксидазно-го метода, после чего подсчитывали число выживших BrdU+ клеток на срезе в зубчатой фасции (ЗФ) переднего гиппокампа и субвентрикулярной зоне (СВЗ) боковых желудочков. В пределах каждой структуры данные усредняли по всем срезам каждого животного и представляли как среднее число BrdU+ клеток на срезе.
Статистический анализ
Данные (число BrdU+ клеток в ЗФ и СВЗ) подвергали многофакторному дисперсионному анализу (factorial ANOVA) с последующим сравнением групп post-hoc при помощи критерия Манна— Уитни. Корреляции числа выживших BrdU+ клеток в ЗФ с данными поведенческих тестов оценивали при помощи критерия Спирмена. Анализ проводили с использованием статистического пакета Statistica 8.0. Данные представлены в виде M ± SEM.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Все животные, получившие инъекцию ПТЗ, перенесли тонико-клонические судороги силой 3.9 ± 0.2 балла по стандартной шкале [7] в течение 20 мин после укола. Уровень смертности после судорог составил в среднем 20%, причем преконди-ционирование ТНС не влияло на уровень смертности (р > 0.1, тест х-квадрат).
В эксперименте 1 подсчитывали клетки, которые находились на ранней стадии дифференци-ровки во время воздействия ПТЗ и/или ТНС и
О о
СО 8
о (U ft о
S 6
Я
о н
ч 4
м
+
13 0
|н 2 «
о
4 о
5 п
Контроль ПТЗ ТНС
ПТЗ + + ТНС
ТНС+ + ПТЗ
О о
З 8
о (U
р
о
S 6
PQ
0
^ Контроль ПТЗ ТНС ТНС+ ПТЗ +
+ ПТЗ + ТНС
Рис. 2. Число Вп!и+ клеток на срез в зубчатой фасции дорсального гиппокампа через 90 дней после судорог. а. Эксперимент 1 (введение ВМи перед ТНС и/или ПТЗ); * отличие от контрольной группы, р < < 0.05 (тест Манна—Уитни); ** отличие от группы, получившей ПТЗ, р < 0.05 (тест Манна—Уитни); п = = 4—5. б. Эксперимент 2 (введение ВМи после ТНС и/или ПТЗ); различий между группами нет; п = 4—5.
выжили в течение трех месяцев. При этой схе
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.