ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, Серия Б, 2009, том 51, № 8, с. 1559-1566
СИНТЕЗ
УДК 541.64:547.466
СВЕРХРАЗВЕТВЛЕННЫЕ ПОЛИЛИЗИНЫ: ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМА ОБРАЗОВАНИЯ1
© 2009 г. Г. П. Власов*, И. И. Тарасенко*, Г. А. Панкова*, И. Е. Ильина*, В. И. Воробьев**
*Учреждение Российской академии наук Институт высокомолекулярных соединений РАН 199004 Санкт-Петербург, Большой пр., 31 **Учреждение Российской академии наук Институт цитологии РАН 194064 Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., 4 Поступила в редакцию 09.04.2008 г.
Принята в печать 12.02.2009 г.
С целью выяснения механизма образования сверхразветвленных полилизинов, образующихся в ходе полимеризации М-карбоксиангидрида №-карбобензоксилизина в условиях восстановительного удаления №-карбобензоксигруппы, проведен синтез сверхразветвленного полилизина с использованием трифторуксусной кислоты в качестве обрывателя полимеризации М-карбоксиангидрида. Строение полученных полимеров установлено с помощью методов капиллярного электрофореза, ГПХ низкого давления, кругового дихроизма и ферментативного гидролиза трипсином. Показано, что на первом этапе синтеза образуется низкомолекулярное сильно разветвленное "ядро" полимера. На втором этапе к аминогруппам М-концевых фрагментов лизина низкомолекулярного сверхразветвленного "ядра" одноточечно своими карбоксильными концами прививаются полилизиновые цепи.
ВВЕДЕНИЕ
Модификация биологически активных веществ высокомолекулярными соединениями является сегодня одним из приоритетных направлений поиска новых биологически активных соединений [1]. В последние десять лет в этой области полимерной химии наметилась тенденция смещения интересов в область создания невирусных носителей ДНК, т.е. полимеров, способных обеспечить целевой транспорт ДНК в ядро клетки для решения задач генной терапии [2]. К носителям ДНК предъявляются те же требования, что и к носителям других биологически активных веществ: они должны обеспечить целевой транспорт ДНК, должны быть биосовместимыми, биодеградируе-мыми и неиммуногенными. В результате был определен круг наиболее перспективных носителей ДНК, которые, как правило, представляют собой поликатионы, их структура близка к сферической. Среди носителей ДНК изучали лизи-новые и полиамидоаминные дендримеры [3—10], разветвленный полиэтиленимин [11, 12] и кати-онные липосомы [13, 14]. Лизиновые дендримеры — наиболее перспективные из носителей ДНК, поскольку они полностью биосовместимы, биодеградируемы и неиммуногенны. Однако синтез лизиновых дендримеров с использовани-
1Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (коды проектов 04-03-33032 и 07-03-00290).
E-mail: gpvlasov@hq.macro.ru (Власов Геннадий Петрович).
ем методов пептидной химии трудоемок и длителен, и с ростом номера генерации получаемых дендримеров значительно увеличивается опасность образования "дефектов" в их структуре [15]. Выходом из такой ситуации может быть использование в качестве полимерных носителей суперразветвленных полиаминокислот, которые можно рассматривать как "дефектные" дендри-меры. Один из примеров новых носителей этого типа — дендриграфты на основе лизина [16]. Однако получение подобных сверхразветвленных полимеров, как и получение лизиновых дендриме-ров, включает достаточно длительный пошаговый синтез. Другим примером служат недавно предложенные нами сверхразветвленные полиаминокислоты на основе лизина. Практически одностадийное их получение происходит при полимеризации М-карбоксиангидрида №-карбо-бензоксилизина в условиях восстановительного удаления защитной №-карбобензоксигруппы [17]. С целью выяснения механизма образования сверхразветвленных полилизинов и выявления возможности направленного регулирования архитектуры и свойств носителей биологически активных веществ мы изучили возможность синтеза сверхразветвленного полилизина в условиях обрывания полимеризации М-карбоксиангидрида с одновременной модификацией гистидином М-концевых аминогрупп. Это происходит при проведении полимеризации М-карбоксиангидрида №-карбобензок-силизина в присутствии обрывателя цепи активированного эфира №-трет-бутилоксикарбонил-ги-стидина [18]. В продолжение этих исследований в
1559
Таблица 1. Количество М-концевых аминогрупп лизина (число точек ветвления) в сверхразветвленном полилизине, полученном прерыванием полимеризации М-карбоксиангидрида
Время реакции полимеризации, ч M х 10-3 Количество N-концевых групп лизина*
1 6 16
2 9 17
96 10-170 27
* Данные капиллярного электрофореза с учетом ММ поли-
меров.
настоящей работе мы сообщаем о синтезе сверхраз-ветвленных полиаминокислот с использованием трифторуксусной кислоты в качестве обрывателя полимеризации N-карбоксиангидрида. Применение обрывателя — регулятора полимеризации N-карбок-сиангидрида №-карбобензоксилизина дало нам возможность, с одной стороны, подтвердить механизм образования полимеров, с другой стороны, направленно создать как низкомолекулярные сверх-разветвленные полилизины, так и звездообразные полилизиновые конъюгаты сверхразветвленных полилизинов, имеющих низкомолекулярное сильно разветвленное "ядро", и одноточечно привитые к этому "ядру" линейные полилизиновые цепи.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Реактивы
В работе использовали №-карбобензоксили-зин, трифосген, палладий, трифторметансульфо-кислоту, трифторуксусную кислоту, тиоанизол, этандитио л, д инитро фенил - (DN P) - пр оизв од-ные аминокислот: Na-DNP-лизина, N^DNP-ли-зина, Na, N£-ди-DNP-лизина производства "Flu-ka" (Германия). Растворители (открытое акционерное общество "Вектон", Санкт-Петербург) очищали и сушили перед использованием.
Оборудование
Полимеры очищали с помощью гель-хроматографии на колонках, заполненных BioGel P2 (BIORAD Laboratories, США), детектирование выполняли на спектрометре "2138 Uvi^^-S" (LKB, Швеция). Вторичную структуру полимеров изучали методом кругового дихроизма на дихрогра-фе "Mark V" ("Jobin Ivon", Франция). Элементы вторичной структуры рассчитывали, используя программу CDNN V2.1 (Gerald BÖhm / Institute für Biotechnologie Martin — Luther — Universität Hall — Wittenberg, Germany. http://bioinformatik.biochemtech. uni-hall.de/cd_spec/references.htm).
Капиллярный электрофорез проводили на приборе "Анализатор капиллярный ионнный "Нанофор-01" производства Института аналити-
ческого приборостроения РАН (Санкт-Петербург, Россия).
Синтез сверхразветвленного поли-Ь-лизина в условиях каталитического удаления
Ы£-карбобензоксизащиты при использовании восстанавливающей системы муравьиная кислота—палладиевая чернь (табл. 1, полимер 1)
К раствору в 69 мл диоксана 1.38 г М-карбок-сиангидрида №-карбобензокси^-лизина, полученного при взаимодействии №-карбобензокси-L-лизина с трифосгеном по методу [19], прибавляли 140 мг палладия и 2.07 г безводной муравьиной кислоты. Через 1 ч перемешивания в реакционную среду добавляли 0.5 мл трифторуксусной кислоты, палладиевую чернь отфильтровывали, промывали 10 мл диоксана. После отгонки диоксана на вакуумном испарителе до объема 5 мл полимер высаживали в 50 мл эфира. Выпавший полимер фильтровали и сушили в эксикаторе, получили 670 мг полимера.
Снятие защитных групп с полимера
В круглодонную колбу с магнитной мешалкой помещали 670 мг полимера, растворенного в 6.7 мл трифторуксусной кислоты. К раствору прибавляли при перемешивании 0.67 мл тиоани-зола и 0.67 мл трифторметансульфокислоты. Смесь перемешивали 0.5 ч при 0°С и еще 1 ч при комнатной температуре. Затем деблокированный полимер высаживали в 50 мл сухого серного эфира. Выпавший полимер отфильтровывали, вновь растворяли в 10 мл трифторуксусной кислоты и высаживали в 50 мл серного эфира. Полимер отфильтровывали и сразу подвергали очистке с использованием гель-хроматографии.
Очистка полимера с использованием гель-хроматографии
Полимер растворяли в 2 мл 6%-ной уксусной кислоты и наносили на колонку (60 х 2.5 см), заполненную BioGel Р-2. В качестве подвижной фазы использовали 6%-ную уксусную кислоту. Соответствующую фракцию лиофилизовали. Получили 71.1 мг полимера. Аналогично с учетом изменений времени полимеризации получили другие сверхразветвленные полилизины (табл. 1 и 2).
Определение ММ и ММР полимеров с использованием ГПХ
Определение ММ и ММР полимеров выполняли на колонке (1 х 50 см), заполненной сефа-дексом G-200, калиброванной белками: тирогло-булином (М = 669 х 103), апоферритином (М = = 443 х 103), бычьим сывороточным альбумином (М = 66 х 103), овальбумином (М = 45 х 103), трип-
сином (М = 23.6 х 103) и лизоцимом (М = 14.3 х 103). В качестве элюента использовали 0.15 М NaCl, скорость элюции 6 мл/ч, детектирование на спектрофотометре СФ 26 при длине волны 230 нм. Хроматографические профили для исследованных полимеров представлены на рис. 1.
Определение N-концевых аминогрупп в полимерах с помощью капиллярного электрофореза
1.2 мг полимера растворяли в 3 мл бикарбонат-ного буфера (рН 8.6) и обрабатывали при комнатной температуре в течение 12 ч раствором 5 мг ди-нитрофторбензола в 3 мл диоксана. Выпавший модифицированный полимер отфильтровывали, промывали водой, спиртом и эфиром. После сушки в эксикаторе полимер гидролизовали в 6 N соляной кислоте в ампуле при 110°C в течение 24 ч. После отгонки водного раствора соляной кислоты на вакуумном испарителе остаток использовали для определения количества динитрофенилпро-изводных аминокислот (DNP-аминокислот) с помощью капиллярного электрофореза.
Капиллярный электрофорез DNP-производ-ных концевых аминокислот проводили по аналогии с работой [18] в 5 мМ фосфатном буфере (рН 7.1) в кварцевом капилляре с общей длиной 45 см (длина до детектора 38 см) и внутренним диаметром 75 мкм при напряженности поля 330 В/см. Детектирование осуществляли при 360 нм. Найденные значения количества N-концевых остатков лизина для сверхразветвленных полили-зинов представлены в табл. 1.
NH-Z
(ÇH2)4
NH-CH-C(=O)
I I
(O=)C-O
[H]/Pd
NH2 I 2 (CH2)4 NH-CH-C(=O)
I I
(O=)C-O
N-CA
NH-Z
I
Ферментативный гидролиз полилизинов в присутствии трипсина
К 3 мл раствора полилизина с концентрацией 3.0, 1.5, 1.0, 0.5 и 0.25 мг/мл в 0.1 М KCl добавляли
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.