МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 84, № 2, с. 160-164
= ОБЗОРЫ
УДК 575.113:575.174.015.3:575.224:577.152.32
СВЕРХСИНТЕЗ ИНВЕРТАЗЫ МОЖЕТ ОБЕСПЕЧИТЬ СЕЛЕКЦИОННЫМ ШТАММАМ ЗЛССИЛЮМУСЕБ СЕЯЕУШЛЕ ФЕРМЕНТАЦИЮ ИНУЛИНА
© 2015 г. Г. И. Наумов*, Е. С. Наумова
Научно-исследовательский центр биолого-медицинских технологий, Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и
ароматических растений РАН, Москва Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва Поступила в редакцию 08.04.2014 г.
В связи с публикациями о селекционных штаммах Яасскаготусея сегегг.пае, якобы обладающих ину-линазой, в обзоре обобщены литературные сведения, позволяющие считать, что в действительности имел место сверхсинтез инвертазы — обычного фермента этих дрожжей.
Ключевые слова: дрожжи, Saccharomyces cerevisiae, Р-фруктозидаза, инвертаза, инулиназа, гены SUC, катаболитная репрессия, инулин, полифруктозиды.
DOI: 10.7868/S0026365615020093
Известны экстраординарные сообщения [1—6] из нескольких лабораторий о селекции штаммов Saccharomyces cerevisiae, активно усваивающих инулин и, по мнению ряда авторов, обладающих инулиназой — специфическим ферментом, гид-ролизирующим инулин. Несмотря на то, что Р-фруктозидазы (инвертазы) дрожжей Saccharomyces изучаются более 150 лет, никто никогда не находил у них другой Р-фруктозидазы с полноценной инулиназной активностью. В настоящем сообщении, исходя из литературных данных, мы обосновали так называемую "инулиназную активность" дрожжей S. cerevisiae сверхсинтезом обычной инвертазы.
Полисахарид инулин, состоящий из несколько десятков остатков фруктозы, соединенных Р-1,2-связью, нашел широкое применение в медицине, пищевой промышленности и биотехнологии [7, 8]. Инулин содержащее сырье, прежде всего топинамбур (Helianthus tuberosus), девясил (Inula helenium), артишок (виды рода Cynara), георгин (виды рода Dahlia), цикорий (виды рода Cichorium), спаржа (Asparagus racemosus), якон (Smallanthus sonchifolius) и голубая агава (Agave tequilana), может быть заменителем крахмала, глюкозы, мальтозы и сахарозы в ферментационных процессах после его гидролиза специфической Р-фруктозидазой (инулиназой). Продуцентами реперной дрожжевой инулиназы являются представители рода Kluyveromyces, в частности K.
1 Автор для корреспонденции (e-mail: gnaumov@yahoo.com).
marxianus (syn. K. cicerisporus, K. fragilis и K. marx-ianus var. bulgaricus) [9, 10]. Эти дрожжи не являются традиционными в пищевой биотехнологи-ии, поэтому в ферментации инулина для пищевых и медицинских целей более подходящими могли бы быть хорошо зарекомендовавшие себя культурные дрожжи S. cerevisiae. Однако их ин-вертаза гидролизует инулин с низкой скоростью. Есть ли пути преодоления этих трудностей? Ответ на этот вопрос может дать генетика Р-фруктози-дазы дрожжей S. cerevisiae.
ПОЛИМЕРНЫЕ В-ФРУКТОЗИДАЗНЫЕ ГЕНЫ SUC И РЕГУЛЯЦИЯ ИХ ЭКСПРЕССИИ
Хорошо известно, что S. cerevisiae, также как и его виды-двойники S. arboricola, S. bayanus, S. ca-riocanus и S. mikatae, не усваивают инулин; исключением являются S. kudriavzevii [11]. Как мы уже отмечали, инвертаза гидролизует инулин с низкой скоростью, поэтому не может обеспечить рост дрожжей на инулине.
Многочисленные исследования, проведенные в разных лабораториях, свидетельствуют, что Р-фруктозидаза дрожжей S. cerevisiae кодируется полимерными кумулятивными очень близкородственными генами SUC (SUC1—SUC5 и SUC7—SUC10), расположенными в теломерных мобильных районах ряда хромосом [12—16]. С каждого гена SUC транскрибируются две мРНК (1.9 и 1.8 т.п.н.), различающиеся 5'-концами. Только большая мРНК кодирует сигнальный
СВЕРХСИНТЕЗ ИНВЕРТАЗЫ
161
пептид, который определяет секретируемость основной по содержанию и функции гликозилиро-ванной инвертазы, тогда как мРНК меньшего размера кодирует минорную внутриклеточную инвертазу неизвестного назначения [17].
Все штаммы S. cerevisiae обладают активным геном SUC2 или в редких случаях молчащей последовательностью (псевдогеном) suc2 [16, 18, 19]. Культурные штаммы S. cerevisiae, в отличие от природных изолятов, содержат наборы различных генов SUC [20—22]. Никаких особых генов SUC с инулиназной активностью не было обнаружено. Тем не менее, можно априори утверждать, что драматическое увеличение содержания ин-вертазы может привести к быстрому расщеплению инулина и росту на нем дрожжей. Ясно, что рост S. cerevisiae на инулине должен зависеть от регуляции синтеза Р-фруктозидазы. Сверхэкспрессия генов SUC может быть достигнута различными способами. Еще Willstatter [23] на заре становления энзимологии предложил метод обогащения пивных дрожжей инвертазой путем медленной подкормки биомассы сахарозой. Последующие многочисленные исследования показали, что синтез Р-фруктозидазы у большинства штаммов S. cerevisiae зависит от катаболитной репрессии продуктами гидролиза сахарозы — глюкозой и/или фруктозой. В одной из первых работ по получению мутантов, нечувствительных к ка-таболитной репрессии, было показано, что такие двухэтапные УФ-мутанты могут при росте на ра-финозе синтезировать в 20—30 раз больше инвертазы, чем исходные дрожжи. При этом инвертаза составляла 1—2% от общего клеточного белка [24]. Другой пример, у мутантов dgr2, со слабой чувствительностью к катаболитной репрессии, полученных с помощью химических мутагенов (нит-розогуанидина и этилметансульфоната), также отмечена суперпродукция инвертазы; исходный штамм имел генотип DGR2 SUC3 [25]. Идентифицировано шесть генов (SNF1—SNF6), отвечающих за глюкозную репрессию локусов SUC [26, 27]. Су-прессорная мутация ssn6 мутантного аллеля snf1 приводит к конститутивному (не чувствительному к глюкозе) высокому уровню синтеза инверта-зы у штамма генотипа SUC2. Еще больший уровень синтеза был у дрожжей генотипа ssn6-1 SNF1 SUC2 — почти в два раза больше, чем у дрожжей дикого типа (SSN6 SNF1 SUC2) в условиях дере-прессии и в 300 раз больше, чем при репрессии глюкозой [28]. Впервые на примере локуса SUC2 показано существование регуляторной области рядом с последовательностью, кодирующей Р-фруктозидазу [29]. Продукт гена SSN6 является репрессором гена SUC2.
Делеции в регуляторной области приводят к дерепрессии синтеза инвертазы. Низкий 10% уровень синтеза инвертазы штамма SUC7, по сравнению со штаммом SUC2, при одном и том
же генетическом бэкграунде может быть обусловлен различиями в регуляторной области [30]. Последующие исследования [31, 32] также показали связь регуляторных элементов с продукцией инвертазы. Было идентифицировано два различных типа TATA-боксов: наиболее экспрессируемые гены SUC1, SUC2 и SUC4 имели последовательности TATAAA, тогда как менее экспрессируемые SUC3, SUC5и SUC7обладали TACAAA. Трансформация штаммов, имеющих различные гены SUC, плазмидами, содержащими множественные копии регуляторных регионов гена SUC4, может увеличивать инвертазную активность как в репрессивных, так и в дерепрессивных условиях [33].
МУТАНТЫ S. CEREVISIAE СПОСОБНЫ УСВАИВАТЬ ИНУЛИН
Малоизвестна очень значимая генетическая работа Grossman [34] по изоляции мутантов, усваивающих инулин, у дрожжей S. cerevisiae, т.к. она была опубликована в виде резюме, к тому же в малораспространенном источнике и только недавно стала доступна в Интернете: http://www.uwo.ca/bi-ology/YeastNewsletter/Index.html.
Приведем без перевода необходимую нам часть сообщения [34]: "A new gene SUC7 has been identified. It is present in a silent form in all strains studied so far. Active mutant alleles can be induced by UV-irradiation and then selected as raffinose fermenters in the case of swc0-strains (no invertase made) or as inuline utilizers in e.g., SUC4-strains. ... Inuline cannot be utilized sufficiently well to support growth of our raffinose fermenting strains. Therefore, it is possible to select mutants utilizing inuline efficiently. This way, it was hoped to isolate mutants with regulatory effects increasing the formation of invertase. In fact, a dominant mutant was found which formed on a raffi-nose medium 18—20 units of invertase, whereas the parent SUC4-strain had only 4—6. The inuline-utiliz-ing mutant was a double mutant with an additional active SUC7-allele and another mutation leading to the excretion of large amounts of invertase already during log-phase." Таким образом, Grossman четко указал на то, что можно получать мутанты со сверхпродукцией инвертазы, проводя их отбор по росту на среде с инулином. Обратим внимание, что этот метод имел прототип. Инулиназный принцип отбора суперпродуцентов инвертазы все тот же, что и на среде с рафинозой в присутствии 2-деокси-D-глюкозы (2ДГ) [25]. Трисахарид рафиноза тоже Р-фруктозид, который может гидролизоваться инвертазой до фруктозы и дисахарида мелибио-зы. Однако рафиноза, по сравнению с сахарозой, имеет низкое сродство к инвертазе, и дополнительное 2ДГ-ингибирование синтеза инвертазы блокирует ферментацию рафинозы [25, 35]. Поэтому мутанты dgr, способные расти на рафинозе в присутствии 2ДГ имели сверхсинтез инвертазы [25, 26].
162
НАУМОВ, НАУМОВА
Принимая во внимание генетический контроль экспрессии генов SUC у дрожжей S. ce-revisiae, проведем анализ интересующих нас публикаций по промышленным селекционным штаммам, способным расти на инулине. В патенте [1] приводятся краткие сведения о получении мутанта Inu+ (ВГШ-2) с помощью комбинированного воздействия УФ-лучами и химическими мутагенами у XII-ой расы S. cerevisiae. У мутанта ВГШ-2 отмечены 2.5—3 кратное увеличение Р-фруктозидазной активности и способность синтезировать инулиназу. В последующей публикации авторов [2] были представлены результаты по синтезу продуцентом эндоинулиназы и выделению этого фермента. В представленных данных по очистке фермента нет информации о разделении инулиназной и инвертазной активностей. В качестве исходного штамма использовалась XII-ая раса, которая была получена из Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) в Пущино, очевидно под номером ВКМ Y-1169. Ранее мы [22] молекулярным кариотипированием и последую-щией Саузерн-гибридизац
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.