ОНТОГЕНЕЗ, 2007, том 38, № 5, с. 386-393
БИОФИЗИКА РАЗВИТИЯ
УДК 577.357, 591.31
СВЕРХСЛАБЫЕ ИЗЛУЧЕНИЯ РАЗВИВАЮЩИХСЯ ЯЙЦЕКЛЕТОК И ЗАРОДЫШЕЙ ШПОРЦЕВОЙ ЛЯГУШКИ1
© 2007 г. И. В. Володяев, Л. В. Белоусов
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова 119899 Москва, ГСП-2, Ленинские горы E-mail: morphogenesis@mail.ru Поступила в редакцию 11.12.06 г. Окончательный вариант получен 26.04.07 г.
Измеряли сверхслабые излучения яйцеклеток и зародышей шпорцевой лягушки в спектральном диапазоне 250-800 нм с помощью фотоэлектронного умножителя при нормальном развитии и воздействии стрессорных факторов. Регистрируемые излучения анализировали по нескольким базовым характеристикам: средняя интенсивность, гистограммы, куртозис, линейные тренды и спектры Фурье. Отслеживали связь между этими показателями и стадией развития особи, а также числом особей, находящихся в оптическом контакте друг с другом и под воздействием стрессорных факторов. По средней интенсивности сверхслабые излучения на всех стадиях развития не отличались от фона. Вместе с тем анализ Фурье выявил достоверное присутствие ряда спектральных линий сверхслабых излучений (в диапазоне 10-2-50 Гц) у зародышей 2-11-й стадий развития. В первые 10 мин после активации и оплодотворения яйцеклеток, а также при оптическом взаимодействии групп зародышей отмечено достоверное снижение интенсивности сверхслабых излучений. Резкое охлаждение, повышение осмотического давления среды и помещение в среду, лишенную ионов Са2+ и Mg2+, вызывало кратковременное (~1-5 мин) повышение средней интенсивности сверхслабых излучений. Исследовали особенности сверхслабых излучений различных частей зародыша. Интенсивность излучения анимальной области ранней бластулы превышала таковую вегетативной области и целого зародыша. Отсепарованные фрагменты латеральной эктодермы на стадии нейрулы имели более высокую среднюю интенсивность сверхслабых излучений, чем интактные зародыши той же стадии развития.
Ключевые слова: сверхслабые излучения, оптические взаимодействия,Xenopus laevis, спектры Фурье.
Измерение сверхслабых излучений (ССИ) в видимой области спектра и их анализ в настоящее время широко используются для оценки физиологического состояния самых различных биологических объектов и патологических процессов в них - от микроорганизмов до человека (Slawinsky, 1990; Ina-ba, 1995; Scordino et al., 1996; Vogel, Sussmuth, 1998; Triglia et al., 1998; Niggli, 2003 ). Ранее (Grasso et al., 1991) показана связь средней интенсивности ССИ с клеточными циклами и ее повышение под действием стрессорных факторов (так называемое деграда-ционное ССИ). На различных биологических объектах (микроорганизмы, культуры дафний, ткани млекопитающих) было показано, что при увеличении числа взаимодействующих объектов интенсивности ССИ падают до значений, ниже средней интенсивности ССИ среды (Galle, 1992; Van Wijk et al., 1993; Vogel, Sussmuth, 1998). Это явление было названо субрадиацией. Согласно утверждению некоторых исследователей (Popp, Klimek, 2006), субради-
1 Работа поддержана Международным научно-техническим центром (проект < 3360).
ация не сводится к классическому поглощению объектами сверхслабой хемилюминесценции среды и имеет квантовую природу. По другим данным (Van Wijk et al.,1993), явление субрадиации наблюдается в культурах нормальных, но не малигнизиро-ванных клеток.
Во многих работах (Николаев, 1992; Бурлаков и др., 1999; Будаговский, 2004 ) широко обсуждается возможность взаимодействия биообъектов посредством ССИ. Получены данные о возможной связи этих явлений с субрадиацией, наблюдаемой уже в первые десятки минут после начала взаимодействий по падению средней интенсивности ССИ (Be-loussov et al., 2003).
Дальнейший прогресс в исследованиях ССИ в известной мере тормозится тем, что многие из них выполняются на объектах, редко используемых в международной лабораторной практике. В связи с этим мы задались целью провести комплексные исследования ССИ на одном из наиболее распространенных модельных объектов биологии развития - развивающихся яйцеклетках и зародышах
шпорцевой лягушки Xenopus laevis Daudin. Были поставлены следующие задачи:
1. Выяснить, существует ли связь между базовыми характеристиками ССИ (средней интенсивностью, спектрами Фурье и др.) и стадией развития зародышей.
2. Определить, наблюдается ли явление субрадиации при оптических взаимодействиях групп зародышей X. laevis (в отсутствие химических контактов между ними).
3. Исследовать, как изменяются ССИ яйцеклеток и зародышей X. laevis под действием стрессор-ных факторов - резкого охлаждения, осмотического шока, помещения в среду без Са2+ и Mg2+ и при нарушении целостности объекта.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Получение и инкубация материала, процедура измерений ССИ. Работу проводили в лаборатории Международного института биофизики (International Institute of Biophysics: www.lifescientists.de) на яйцеклетках, зародышах и личинках шпорцевой лягушки Xenopus laevis Daudin. Яйцеклетки получали методом гормональной стимуляции. Неактивированные яйцеклетки инкубировали в растворе MMR (0.1 М NaCl; по 2 мM KCl и CaCl2; 1 мM MgSO4; 0.1 мM ЭДТ\; 0.1 мM HEPES, pH 7.8). Для активации, искусственного оплодотворения и последующего развития яйцеклетки помещали в 10%-ный MMR. Стадии развития определяли по таблицам нормального развития (Nieuwkoop, Faber, 1956).
Для регистрации ССИ материал содержали в кюветах двух типов: 1) стандартные кварцевые с внутренними поперечниками 48 х 22 х 2 мм и 40 х х 10 х 2 мм, в которые помещали от 5 до 16 яйцеклеток или зародышей; 2) специально изготовленные в Институте биологического приборостроения РАН (Пущино) многоячеистые (64 ячейки) плоские стеклянные с изолированными лунками 3 х 3 х 3 мм, разделенными стеклянными перегородками толщиной 1.1 мм. В каждую лунку помещали по одной яйцеклетке или зародышу. Всего в кюветах находилось от 1 до 10 зародышей.
Регистрацию ССИ проводили с помощью люме-нометра (катод фотоэлектронного умножителя (ФЭУ): EMI 9558 QA, диапазон чувствительности 250-800 нм, ФЭУ в режиме счета фотонов (технические детали см.: Mieg et al., 1992)). Времена накопления фотонов - 10-3, 10-2 и 10-1 с; длительность измерений - 1, 5, 20, 100 мин и 12 ч.
В камере люменометра в каждой отдельной серии измерений поддерживали температуру 22-25°С с точностью до 0.5°С. Вне камеры при той же тем-
пературе инкубировали часть той же кладки и контролировали ее развитие по времени.
Использовали следующие варианты опытов.
1. Регистрация ССИ по ходу нормального развития. Для измерений длительностью не более 100 мин использовали многоячеистые кюветы, в которые помещали от 1 до 5 яйцеклеток или зародышей. Для более длительных измерений зародыши помещали в стандартные кварцевые кюветы.
Регистрацию ССИ после активации или оплодотворения яйцеклетки начинали через 12-15 с после активации или оплодотворения (в той же кювете). Сигнал сравнивали с ССИ одиночных неактивированных яйцеклеток через те же сроки после их помещения в раствор MMR. Время накопления фотонов - 10-2 с, полное время измерений - 5 мин.
Для измерений ССИ в период синхронных делений дробления от одной до пяти яйцеклеток помещали в лунки многоячеистой кюветы через 1 ч после оплодотворения in vitro. Измерения проводили в течение 100 мин (время накопления фотонов -10-1 с) и в течение 5 мин (время накопления фотонов - 10-2 с). Прохождение борозд дробления определяли по контрольной части той же кладки, находящейся при той же температуре вне камеры люменометра и по таблицам нормального развития (Nieuwkoop, Faber, 1956).
2. Влияние оптических взаимодействий между зародышами ст. 19 или личинками ст. 37 на динамику их ССИ. Опыты проводили в двух модификациях.
а. Перед катодом ФЭУ параллельно ему устанавливали две стандартные кварцевые кюветы: "переднюю" - у катода, и "заднюю", полностью заслоненную передней от катода. Повторно сравнивали три следующих варианта: I. В передней кювете - пять зародышей, в задней (также заполненной равным объемом 10%-ного MMR) - ни одного. II. В обеих кюветах по пять зародышей (ожидаются оптические взаимодействия). III. В обеих кюветах - ни одного зародыша. Время накопления - 10-1 с, длительность сеанса измерений - 100 мин.
б. Зародыши ст. 19 (один, два или десять) или личинки ст. 37 (одну или пять) помещали в смежные лунки многоячеистой кюветы, которую устанавливали вертикально перед катодом ФЭУ (время накопления - 10-2 с, длительность сеанса измерений -5 мин).
3. Получение деградационного ССИ при обратимых стрессорных воздействиях (время накопления - 10-1 с, длительность сеанса измерений -20 мин). Применяли следующие типы воздействий:
а. Холодовой шок испытывали на зародышах ст. 19 и личинках ст. 37. В первом случае партию из
16 зародышей переносили из комнатной температуры (23°С) в стандартную кювету с 0.1%-ным MMR, предварительно охлажденную до 6°С, и через 20-30 с начинали измерения в камере ФЭУ (в которой по техническим условиям сохранялась температура 23°С). Аналогичные контрольные измерения проводили с охлажденной кюветой без зародышей. Во втором случае одну активно плавающую личинку помещали в лунку многоячеистой кюветы, которую устанавливали вертикально перед катодом ФЭУ. Проводили аналогичные процедуры.
б. Осмотический шок получали погружением партии из пяти зародышей ст. 11-12 (средняя га-струла) в раствор 0.5-1 M сахарозы на основе 10%-ного MMR. Интенсивность ССИ сравнивали с таковой в 10%-ном MMR без сахарозы, а также с фоном (кювета с 10%-ным MMR без зародышей).
в. Зародыши различных стадий развития (от
ст. 8 до ст. 19) помещали в 10%-ный MMR без Са2+, Mg2+. Измерения начинали через 20-30 с.
г. Вырезание квадратных фрагментов эктодермы площадью ~1 мм2 из латеральной области зародышей ст. 19-20. Регистрацию ССИ фрагментов начинали через 20-30 с после их вырезания и продолжали в течение 10 мин, сравнивая с ССИ тех же зародышей до вырезания. Период накопления - 10-1 с.
Анализ полученных результатов и оценку их достоверности проводили в пакете программ STA-TISTICA и в среде MATLAB. Использовали следующие характерист
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.